孫君燕，孫 敏，宋詩清，王化田，馮 濤，姚凌云, ，俞文華

（1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精化妝品學(xué)部，上海 201418；2.寧波華木來生物科技有限公司，浙江寧波 315131）

香榧（Torreya grandis）是紅豆杉科榧樹屬植物，為我國特有的經(jīng)濟(jì)樹種。香榧果實(shí)（香榧子）作為藥食兩用植物資源在我國具有悠久的應(yīng)用歷史，該果實(shí)外面裹有一層的肉質(zhì)化假種皮，約占鮮重的50%～60%，長期被當(dāng)作香榧子加工廢棄物而沒有得到有效利用，同時(shí)對(duì)環(huán)境造成不良影響[1-2]。近年來，隨著對(duì)香榧假種皮化學(xué)成分和生物活性研究的深入，其開發(fā)價(jià)值逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，研究表明，香榧假種皮富含二萜、黃酮等多種活性次級(jí)代謝產(chǎn)物，可產(chǎn)生抗氧化、抑菌、抗病毒、抑止酪氨酸酶等生物活性，可作為芳香油和藥用活性浸膏提取的天然優(yōu)質(zhì)原料[3-4]。

目前關(guān)于香榧假種皮的植物精油成分及生物活性已有一些報(bào)道。香榧精油主要含α-蒎烯、δ-杜松烯、D-檸檬烯等揮發(fā)性成分，具有抗氧化、酪氨酸酶抑制等活性[5-7]。純露是提取精油過程中伴隨產(chǎn)生的副產(chǎn)物，一般是指在精油蒸餾萃取過程中，分離出來的一種飽和的蒸餾原液，其中含有植物水溶活性成分，同時(shí)保留精油芳香，在食品、化妝品中常直接使用或作為溶劑應(yīng)用[8-10]。香榧精油的提取過程中同樣會(huì)產(chǎn)生大量的純露，但香榧純露的揮發(fā)性物質(zhì)組成及生物活性的研究目前還尚未見報(bào)道。

本文通過LUMi Sizer穩(wěn)定性分析儀對(duì)不同工藝處理香榧純露的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，利用氣相色譜-質(zhì)譜分析（GC-MS）技術(shù)對(duì)純露的化學(xué)成分進(jìn)行分析，并進(jìn)一步通過體外抗氧化及秀麗隱桿線蟲的氧化應(yīng)激試驗(yàn)探究了香榧純露的抗氧化活性，為香榧資源的深加工和香榧純露的合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生型（N2）秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans） 上海南方模式生物科技股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；重鉻酸鉀、5-氟脫氧尿（5-fluoro-2‘-deoxy-β-uridine） Sigma公司；膽固醇、抗壞血酸（VC）、氯化鈉、氯化鈣、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂等試劑 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉 生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物 英國OXOID公司。

UV2350型紫外可見分光光度計(jì) 上海尤尼科儀器有限公司；SPME萃取頭 （100 μm CAR-PDMSDVB） 美國Supelco公司；GC-MS（7890A-5975C）安捷倫科技（中國）有限公司；LUMi Sizer穩(wěn)定性分析儀 羅姆（江蘇）儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱

上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；恒溫水浴鍋常州市人和儀器廠；FA1604型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DHG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 香榧純露的提取 新鮮香榧假種皮在2020年10月采集于浙江會(huì)稽山一帶，4 ℃冷庫存放備用。稱取50 kg香榧假種皮置于500 L不銹鋼蒸餾塔，加入350 L去離子水蒸餾，蒸餾溫度為90 ℃，冷凝溫度0 ℃，蒸餾時(shí)間2.5 h。蒸餾收集的冷凝液通過離心（1500 r/min × 10 min）后進(jìn)行油水分離，上層為香榧精油，下層為香榧純露原液。香榧純露原液經(jīng)0.25 μm膜過濾處理獲得過濾香榧純露，兩種純露樣品無菌灌裝后均置于冰箱 （4±2）℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 香榧純露穩(wěn)定性的測(cè)定 LUMi Sizer穩(wěn)定性分析儀對(duì)純露樣品進(jìn)行物理穩(wěn)定性評(píng)估。儀器測(cè)定樣品在離心作用紅外透光率并繪制曲線，不穩(wěn)定系數(shù)是指透光率積分對(duì)時(shí)間的曲線的斜率[11-12]。取香榧純露樣品注入到PC管樣品皿底部，溫度設(shè)定為25 ℃，離心轉(zhuǎn)速為4000 r/min，透射率的特征線每60 s記錄1次，共計(jì)1000次。通過不同時(shí)間的樣品的透光率-位置圖譜（指紋圖）和不穩(wěn)定系數(shù)柱狀圖，可定性評(píng)估香榧純露的長期物理穩(wěn)定性。

1.2.3 氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析 氣相色譜條件：GC-MS（7890A-5975C）升溫程序：初始溫度50 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升至120 ℃，保持3 min，再以8 ℃/min升溫至280 ℃，保持5 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為N2，流速為1 mL/min，分流比15:1。質(zhì)譜條件：接口溫度 280℃，電子轟擊（EI）源，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍33.00～55.00 amu，電子倍增器電壓1000 V，溶劑延遲時(shí)間3 min。樣品處理：先將SPME纖維萃取頭插入氣相色譜儀預(yù)處理30 min進(jìn)行老化，溫度為250 ℃；取5.0 mL香榧純露置于頂空瓶中，加入2-辛醇10 μL（400 ppm），混合后置于45 ℃平衡20 min，然后將老化好的萃取頭置入頂空瓶的上部頂空，于55 ℃吸附30 min，然后取出萃取頭取出并直接插進(jìn)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）。利用NIST11和NIST11s標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫對(duì)采集到的質(zhì)譜圖進(jìn)行檢索，采用色譜峰面積歸一化法定量。

1.2.4 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn) 參考Pavlic等[13]的實(shí)驗(yàn)方法并稍作調(diào)整。對(duì)照溶液：取1 mL的2×10-4mol/L DPPH溶液加水使最終體積為4 mL，室溫下避光30 min后，在517 nm處測(cè)量吸光值，記為A0；樣品溶液：取1 mL的DPPH溶液分別與1 mL不同濃度的香榧純露（20、40、60、80、100 mg/mL）混合，加水使最終體積為4 mL，測(cè)量不同濃度香榧純露的吸光度，記為A。實(shí)驗(yàn)以相同質(zhì)量濃度的VC作為陽性對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)3次，DPPH自由基清除率（%）=（A0-A）/A0×100。

1.2.4.2 ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn) 參照Bai等[14]的方法并適當(dāng)修改，將等體積（50 mL）7 mmol/L的ABTS與2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，室溫下避光12～16 h，得到ABTS+儲(chǔ)備液，使用前用無水乙醇稀釋，使其在734 nm波長下的吸光度為 0.70±0.02，即得 ABTS+工作液。對(duì)照溶液：取一支10 mL試管，加入ABTS+工作液1.0 mL和無水乙醇3.0 mL于試管中至終體積4.0 mL，靜置30 min，在734 nm波長處測(cè)吸光度，記為A0；樣品溶液：取數(shù)支10 mL試管分別加入1 mL不同濃度的香榧純露（20、40、60、80、100 mg/mL）溶液，加入無水乙醇2.0 mL，再加入ABTS+工作液使最終體積為4.0 mL，避光靜置反應(yīng)30 min，在734 nm波長處測(cè)吸光度，記為A。實(shí)驗(yàn)以相同質(zhì)量濃度的VC作為陽性對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)3次，ABTS自由基清除率（%）= （A0-A）/A0×100。

1.2.5 秀麗隱桿線蟲實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)中所采用的線蟲品系為野生型（N2）秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans），培養(yǎng)線蟲使用的培養(yǎng)基為表面涂布E. coliOP50的線蟲標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基（NGM），在20 ℃下培養(yǎng)，相對(duì)濕度為40%。

1.2.5.1 線蟲同期化處理 一條產(chǎn)卵期線蟲1 h可以產(chǎn)卵8個(gè)左右。為得到同步生長的線蟲，挑取進(jìn)入產(chǎn)卵期的線蟲若干條在一個(gè)平板中，把平板置于20 ℃恒溫箱中孵育，孵育約2 h后，將平板中線蟲挑出，平板中的卵孵化后即處于同一發(fā)育時(shí)期[15-16]。收集同期化線蟲，進(jìn)行氧化應(yīng)激及線蟲壽命試驗(yàn)。

1.2.5.2 重金屬Cr6+應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 參考Yuen等[17]方法進(jìn)行適當(dāng)修改，取同期化之后正常生長至L4期（約3 d）的秀麗隱桿線蟲幼蟲，隨機(jī)分組（空白對(duì)照組、樣品組、VC對(duì)照組）置于3 cm的培養(yǎng)皿，每組培養(yǎng)皿中200條幼蟲，培養(yǎng)48 h，分別加入1.7 mL的完全培養(yǎng)基，0.2 mL不同濃度的香榧純露，0.1 mL的OP50（0.1 g/mL），空白對(duì)照組用無菌水代替純露樣品，陽性對(duì)照以0.05 mg/mL的VC溶液代替純露樣品，培養(yǎng)完成后，用移液槍將每組樣品吸入到EP管中，用 M9緩沖液沖洗到EP管中，沖洗3遍，除去試樣、大腸桿菌 OP50和已經(jīng)死亡的成蟲后，將線蟲分配在96孔板的孔中，對(duì)照組及純露樣品處理組線蟲均分3個(gè)孔，每個(gè)孔不少于30條蟲，每孔加入8 μL的K2Cr2O7（10 mmol/L）和152 μL的M9緩沖液誘導(dǎo)線蟲氧化應(yīng)激反應(yīng)，每4 h記錄一次線蟲存活的數(shù)量變化，考察純露處理對(duì)線蟲氧化應(yīng)激的影響。

1.2.5.3 線蟲壽命試驗(yàn) 將單條線蟲挑入含有液體完全培養(yǎng)基的96孔板的每個(gè)孔中，完全培養(yǎng)基中添加2 mg/mL（濕重）OP50和400 μmol/L的5-氟去氧尿苷。試驗(yàn)設(shè)有空白組、樣品組和VC對(duì)照組，純露處理組設(shè)置不同的濃度梯度（香榧純露10倍稀釋液、50倍稀釋液、100倍稀釋液、500倍稀釋液），每d記錄死亡蟲體的數(shù)目[18-19]。以無菌水代替純露樣品作為空白對(duì)照組，以0.05 mg/mL的VC溶液作為陽性對(duì)照，死亡標(biāo)準(zhǔn)是用金屬絲觸碰線蟲，如蟲體不動(dòng)則判為死亡，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行方進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，若無特別說明，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差以（±s）表示，并進(jìn)行t檢驗(yàn)或單向方差分析，P＜0.05為具有顯著差異。在體外抗氧化和線蟲試驗(yàn)中，所得數(shù)據(jù)利用Origin 9.0和GraphPad Prism 8軟件繪制各個(gè)因素的動(dòng)力學(xué)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 香榧純露穩(wěn)定性測(cè)試

通過LUMi Sizer穩(wěn)定性分析儀測(cè)定不穩(wěn)定系數(shù)。不穩(wěn)定系數(shù)反映了樣品的整體不穩(wěn)定性趨勢(shì)情況，其值越接近1，產(chǎn)品分層越嚴(yán)重，越接近于0，表示產(chǎn)品分層現(xiàn)象不明顯，穩(wěn)定性越好[20]。從圖1可知，兩種樣品的不穩(wěn)定系數(shù)均接近0，具有較好的穩(wěn)定性，但非過濾香榧純露的不穩(wěn)定性系數(shù)（0.192±0.009）大于過濾香榧純露（0.007±0.003），過濾純露的不穩(wěn)定系數(shù)更趨近于0，說明純露經(jīng)過濾后穩(wěn)定性大于非過濾純露。香榧假種皮經(jīng)水蒸氣蒸餾提取后，餾出液含香榧精油（油相）和大量的香榧純露（水相）兩相，通過膜過濾工藝處理可更好地富集香味物質(zhì)或提高純露的穩(wěn)定性。

圖1 過濾與非過濾香榧純露不穩(wěn)定性指數(shù)Fig.1 Instability coefficient of filter-treated and untreated T.grandis hydrosols

不同工藝香榧純露樣品通過LUMi Sizer穩(wěn)定性分析儀在25 ℃條件下測(cè)試30 s加速分析后的透光率指紋圖譜見圖2，其中橫坐標(biāo)是樣品管的位置（mm），左端是指樣品管的頂端，右端指的是樣品管的底部，縱坐標(biāo)是透光率數(shù)值（%）。紅色是指初始透光率譜線，綠色是指結(jié)束時(shí)刻的透光率譜線，紅色到綠色譜線的漸變是隨著測(cè)試開始到結(jié)束的變化過程[21]。從圖2可知，過濾純露（圖2B）與非過濾純露（圖2A）相比，初始透光率譜線與結(jié)束時(shí)刻的透光率譜線保持一致，總體具有更好穩(wěn)定性。加速試驗(yàn)中，兩種純露樣品均呈現(xiàn)頂端（105～109 mm）透光率升高，底部（128～130 mm）透光率降低，具有典型的沉降過程[22]。過濾香榧純露（圖2B）在樣品管109～128 mm位置，初始透光率譜線與結(jié)束時(shí)刻的透光率譜線呈較為平整的直線，與非過濾純露（圖2A）相比具有較好的均一穩(wěn)定性。根據(jù)LUMi Sizer穩(wěn)定性分析儀測(cè)試結(jié)果（圖1、圖2），可知經(jīng)過濾處理后的香榧純露具有更好的穩(wěn)定性。

圖2 LUMi Sizer 穩(wěn)定性分析儀評(píng)價(jià)非過濾（A）與過濾（B）香榧純露長期物理穩(wěn)定性結(jié)果Fig.2 Physical stability of untreated （A） and filter-treated （B）T. grandis hydrosols evaluated by LUMi Sizer

2.2 香榧純露揮發(fā)性成分的GC-MS分析

實(shí)驗(yàn)通過HS-SPME結(jié)合GC-MS方法對(duì)香榧純露的揮發(fā)性成分進(jìn)行了系統(tǒng)分析，經(jīng)GC-MS聯(lián)用儀所配置的NIST-MS譜庫進(jìn)行檢索，分析各組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，按峰面積歸一化法測(cè)得各成分相對(duì)質(zhì)量百分含量。在香榧純露中，共鑒定出49種揮發(fā)性物質(zhì)，主要成分包括醇類、萜類、酚類、醛類、烴類、酮類等。從表1可知，共鑒定出21種醇類化合物（41.82%），是純露中主要的揮發(fā)性物質(zhì)，包括3-甲基-3-丁烯-1-醇、3-己烯-1-醇、3-辛醇、1-辛烯-3-醇、2-乙基己醇、芳樟醇、環(huán)己醇、葑醇、4-萜品醇、β-松油醇、2-環(huán)己烯-1-醇、異龍腦、松油醇、2-茨醇、β-香茅醇、橙花醇、對(duì)甲基苯異丙醇、苯乙醇、紫蘇醇、對(duì)異丙基苯甲醇、α-畢橙茄醇。其中，β-香茅醇（5.5%）、松油醇（16.45%）和4-萜品醇（11.14%）相對(duì)含量較大。β-香茅醇有優(yōu)雅的玫瑰香氣，具有抑制金黃色葡萄及傷寒桿菌活性，廣泛應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域[23]。β-松油醇存在于多種精油中，如松油、橙花油等，有似海桐花的清香，甜的紫丁香、鈴蘭氣息[24]。4-萜品醇是茶樹葉揮發(fā)油的主要成分，具有良好的抗氧化活性[25]。

表1 香榧純露成分的GC-MS 分析結(jié)果Table 1 GC-MS analysis of volatile compounds in T. grandis hydrosols

萜類化合物（5.27%）共有7種，包括單萜α-萜品烯、右旋萜二烯、萜品烯、羅勒烯、α-衣蘭油烯、α-蒎烯，除單萜類化合物，還有其他萜類化合物如樟腦。α-萜品烯具有柑橘和檸檬似香氣，常作為香料，制備人造檸檬和薄荷精油。右旋萜二烯別名為D-檸檬烯，有似鮮花的香氣，具有良好的鎮(zhèn)咳、祛痰、抑菌作用，已被廣泛應(yīng)用于食品、香料、日化、醫(yī)藥等行業(yè)[26]；萜品烯可以保護(hù) SOD、GSH-Px 和 CAT 等抗氧化酶的活性，在一定程度上恢復(fù)由過氧化氫引發(fā)的細(xì)胞損傷，起到抗氧化作用[27]。羅勒烯有草香、花香并伴有橙花油氣息，可用于多種日化香精配方中；萜品油烯、α-衣蘭油烯、α-蒎烯用作香料的原料。其中α-蒎烯在一定作用水平下對(duì)大腸桿菌具有明顯的抑制作用。樟腦具有興奮、止痛、除濕、驅(qū)風(fēng)等功效。

酚類化合物有5種，相對(duì)含量為1.58%，包括愈創(chuàng)木酚、2-甲氧基-4-甲基苯酚、甲基丁香酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚、2,6-二叔丁基苯酚；其中愈創(chuàng)木酚有芳香氣味，主要用作殺蟲劑，用于香料和醫(yī)藥等領(lǐng)域；2-甲氧基-4-甲基苯酚可用于威士忌酒的增香劑，也可調(diào)配丁香、熏肉、香莢蘭等食用香精和煙用香精；甲基丁香酚主要用于配制依蘭型、康乃馨型、紫丁香型等香精[28]。

除了醇類、萜類、酚類化合物以外，還有烴類化合物有5種（1.49%），包括1,3-環(huán)己二烯、2,4-二甲基苯乙烯、十六烷和2,2-二甲基-3-亞甲基二環(huán)[2.2.1]庚烷、間異丙基甲苯；醛類化合物有3種，但相對(duì)含量較低（0.24%），包括3-羧基苯甲醛、壬醛、香桃木醛；其中壬醛具有玫瑰、柑橘等香氣，有強(qiáng)的油脂氣味，廣泛用于配制人造玫瑰油和玫瑰型香精，工業(yè)生產(chǎn)中可用作食品、紡織品等的芳香劑或異味掩蓋劑[29]。酮類化合物2種，包括環(huán)己酮（0.17%）和4-羥基-2-甲基苯乙酮（1.19%）；酯類化合物1種，鄰苯二甲酸二丁酯，相對(duì)含量為1.51%，主要作為增塑劑和用于制備香料溶劑、織物潤滑劑等。除此之外，還有酸類如乙酸，及其它類型的揮發(fā)性化合物如吡啶、3-甲氧基吡啶、油酸酰胺和硬脂酰胺等。

在水蒸氣蒸餾提取植物精油過程中，揮發(fā)性成分經(jīng)冷凝后分為油水兩相，即精油和純露，被蒸餾出來植物純露中以醇類、酚類等水溶性成分為主[30]。香榧純露的生物活性相關(guān)的報(bào)道較少，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)針對(duì)香榧純露的生物活性開展了進(jìn)一步的探索。

2.3 體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 DPPH自由基清除試驗(yàn)結(jié)果 DPPH·氧化性強(qiáng)，當(dāng)加入抗氧化物質(zhì)后，DPPH·的產(chǎn)生會(huì)被抑制，顏色由紫變黃[31]。實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了香榧純露的清除DPPH自由基的能力，以VC作為陽性對(duì)照，結(jié)果見圖3，陽性對(duì)照VC在20～100 mg/mL濃度范圍內(nèi)，清除率達(dá)90%以上并趨于平衡，香榧純露達(dá)到100 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)67.3%±1.2%，香榧純露清除DPPH的IC50為73.10 mg/mL（VC為0.018 mg/mL）。以往研究表明，許多植物純露都具有一定的抗氧化活性[32]，本研究中香榧純露對(duì)DPPH自由基的最高清除率高于文獻(xiàn)報(bào)道的玫瑰純露[9]，表明其在功能性食品、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。

圖3 香榧純露對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.3 Effect of T. grandis hydrosols on DPPH free radical scavenging

2.3.2 ABTS自由基清除試驗(yàn)結(jié)果 香榧純露ABTS自由基清除試驗(yàn)結(jié)果見圖4，在20～100 mg/mL濃度范圍內(nèi)，香榧純露對(duì)ABTS自由基清除能力隨著香榧純露濃度增加而增強(qiáng)，在100 mg/mL時(shí)清除率最高并趨于穩(wěn)定，達(dá)到84.2%±3.7%（IC50=37.63 mg/mL）。VC（IC50=0.014 mg/mL）在20～100 mg/mL濃度范圍內(nèi)，對(duì)ABTS自由基清除率均為90%以上，清除率趨于平穩(wěn)。香榧純露對(duì)ABTS自由基的清除率雖然低于陽性對(duì)照VC，但清除率達(dá)到80%以上，表明期具有較好的體外抗氧化活性。

圖4 香榧純露對(duì)ABTS自由基的清除能力Fig.4 Effect of T. grandis hydrosols on ABTS radical scavenging

2.4 秀麗隱桿線蟲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 香榧純露對(duì)線蟲鎘應(yīng)激的影響 重金屬應(yīng)激反應(yīng)是指秀麗隱桿線蟲在一定濃度的重金屬離子中的生存情況，可以反映秀麗隱桿線蟲抵抗重金屬誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激性[33-34]。在96孔板實(shí)驗(yàn)中，通過每孔加入8 μL的K2Cr2O7（10 mmol/L）考察不同樣品對(duì)線蟲存活的影響。從圖5可知，以蒸餾水為樣品的空白對(duì)照存活時(shí)間最短（60 h），添加陽性對(duì)照VC可極顯著提高線蟲存活時(shí)間至64 h（P＜0.01），不同稀釋濃度（10～100倍稀釋）的香榧純露對(duì)線蟲存活時(shí)間的延長同樣顯著（P＜0.05），當(dāng)稀釋達(dá)500倍時(shí)對(duì)線蟲存活時(shí)間無明顯影響（圖5D）。目前已有較多文獻(xiàn)報(bào)道，植物揮發(fā)性成分可以調(diào)節(jié)線蟲自身的氧化應(yīng)激性能并延長線蟲的壽命。如杜松子 （Juniperus communis）精油在較低劑量（10 ppm）顯示出抵抗各種氧化和熱應(yīng)力的潛力，并且可使線蟲的壽命延長18.54%[35]。本研究試驗(yàn)結(jié)果表明，香榧純露在一定濃度內(nèi)具有顯著提高線蟲抵抗重金屬誘導(dǎo)的應(yīng)激能力（圖5A～C），并且與濃度存在相關(guān)性，隨著純露濃度降低（稀釋倍數(shù)增大），其抵抗鎘應(yīng)激能力減弱（圖5D），顯示香榧純露在一定濃度范圍具有對(duì)線蟲的抗氧化應(yīng)激和延長壽命方面的活性。

圖5 香榧純露對(duì)線蟲應(yīng)鎘激抵抗能力的影響Fig.5 Effect of T. grandis hydrosols on stress resistance of C.elegans under stimulation of Cr6+

2.4.2 香榧純露對(duì)線蟲壽命的影響 將同步到L4期的線蟲轉(zhuǎn)移至96孔板，培養(yǎng)基中添加5-氟去氧尿苷（400 μmol/L）抑制線蟲繁殖，每天觀察并記錄線蟲的存活數(shù)量，直至所有線蟲死亡為止，不同濃度香榧純露對(duì)線蟲壽命的影響如圖6所示?？瞻捉M線蟲壽命最長為24 d，添加VC（0.05 mg/mL）和香榧純露可使線蟲的最長壽命延長，添加VC可使線蟲最長壽命延長至30 d，稀釋10、50、100、500倍的香榧純露可使線蟲最長壽命延長至32、28、28、26 d，表2可知，與空白組相比，添加VC的線蟲平均壽命提高29.5%，添加稀釋10、50、100、500倍的香榧純露，線蟲平均壽命依次提高約為30.7%、21.8%、14.3%、7.8%。

圖6 不同稀釋倍數(shù)香榧純露對(duì)線蟲壽命的影響Fig.6 Effect of T. grandis hydrosols on life span of C. elegans

表2 香榧純露對(duì)線蟲壽命的影響Table 2 Effect of T. grandis hydrosols on life span of C.elegans

從表2可知，同空白組相比，添加VC及高濃度香榧純露組可使線蟲平均壽命和中位生存時(shí)間顯著增加。線蟲平均壽命及中位生存時(shí)間的增加與香榧純露的濃度呈正相關(guān)，試驗(yàn)的最高濃度組（香榧純露原液稀釋10倍）的平均壽命、中位生存時(shí)間及最長壽命時(shí)間相比空白組均顯著增加（P＜0.01），且優(yōu)于陽性對(duì)照VC（0.05 mg/L），表明香榧純露在一定濃度范圍具有延緩衰老、延長線蟲壽命的作用。

3 討論與結(jié)論

采用LUMi Sizer穩(wěn)定性分析儀對(duì)非過濾和過濾工藝下香榧純露的穩(wěn)定性進(jìn)行了比較，通過不穩(wěn)定系數(shù)分析及加速試驗(yàn)透光率指紋圖譜對(duì)比，表明過濾香榧純露具有較低的不穩(wěn)定系數(shù)和更好的穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)之上，對(duì)香榧純露的成分與抗氧化活性進(jìn)行了研究。香榧純露通過GC-MS共鑒定出49種化合物，其中醇類化合物占較大比例共21種（41.82%），如松油醇（16.45%）、4-萜品醇（11.14%），7種萜類化合物（5.27%），還有酚類（5種）、醛類（3種）及其他類型揮發(fā)性化合物等。

體外DPPH、ABTS自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果表明，香榧純露具有較好的抗氧化作用，且清除自由基能力在試驗(yàn)中與香榧純露的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。秀麗隱桿線蟲抗氧化應(yīng)激試驗(yàn)結(jié)果表明，香榧純露可以提高線蟲的抗氧化應(yīng)激能力且與濃度呈正相關(guān)，在試驗(yàn)考察的最高濃度（香榧純露原液稀釋10倍）時(shí)其體內(nèi)抗氧化應(yīng)激性能與陽性對(duì)照藥物VC（0.05 mg/L）接近。秀麗隱桿線蟲由于其較短的壽命周期、高度保守的基因和擁有與人相似的衰老通路，常被用作衰老研究的模式生物[36-37]。本試驗(yàn)中線蟲壽命結(jié)果表明，香榧純露在一定濃度范圍可顯著提高線蟲平均壽命及中位生存時(shí)間，而對(duì)于其延緩衰老的成分及作用機(jī)制還需要后續(xù)的進(jìn)一步研究。

香榧是我國特有的植物資源，本文對(duì)香榧假種皮提取精油過程的副產(chǎn)物香榧純露進(jìn)行了成分鑒定和體內(nèi)外抗氧化活性研究，相關(guān)結(jié)果表明香榧純露具有應(yīng)用在抗氧化、抗衰老功能性食品、化妝品上的潛能。本研究結(jié)果為香榧資源的綜合利用和開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)與理論參考，但壽命延長機(jī)制還有待于在今后工作中繼續(xù)深入探究。