鐘潤濤，楊倩倩，劉 琦，張 普，劉清清，邱怡華，彭 威，李沛然，王夢雨，王 巍，孫野青

(大連海事大學 環(huán)境系統(tǒng)生物學研究所，遼寧大連 116026)

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans),是重要的模式生物,是一種微小的多細胞無脊椎[1]、無毒無害、可以獨立生存的小型土壤動物，其主要特點包括：易于培養(yǎng)[2]、雌雄同體、較快的繁殖時間(約3d，20℃)和較短的壽命(約兩周，20℃)[3]、較小的身體尺寸(成蟲體長約1mm長，體寬約50μm)[1]、通身透明，神經(jīng)系統(tǒng)簡單、基因組測序已完成[4]、遺傳背景清楚等。

常規(guī)線蟲研究方法，往往需要每天將線蟲轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，以和后代區(qū)分[5-6]，操作繁瑣、費時費力、通量低，同時難以對單個線蟲實現(xiàn)精確的刺激傳遞、操控和追蹤，無法獲得單線蟲的分析檢測數(shù)據(jù)，在一定程度上影響了結(jié)果的準確性和研究深度。單線蟲水平的研究充分考慮了線蟲的個體差異，可以獲得更豐富、更準確的信息，從而避免群體研究時平均值所帶來的偏差。單線蟲的分離和操控對于單線蟲的研究有很重要的意義，但傳統(tǒng)研究手段難以實現(xiàn)對一定數(shù)量單線蟲的精確控制，且現(xiàn)有方法可能會對線蟲生理產(chǎn)生影響[7]。

微流控芯片，又叫芯片實驗室(Lab-on-a-Chip)，是一種以在微米尺度空間對流體操控為主要特征的技術(shù)，可以實現(xiàn)常規(guī)化學或生物實驗室的各種功能[1]。微流控技術(shù)的特點使其在生物醫(yī)學研究方面實現(xiàn)了微型化、自動化、高時效性、高通量及大規(guī)模檢測等諸多優(yōu)勢[5]。隨著微流控技術(shù)的發(fā)展，微流控芯片系統(tǒng)已成為模式生物線蟲，特別是秀麗隱桿線蟲這種微小生命體研究的強大工具[8-10]。

本研究基于微流體控制技術(shù)，設計了培養(yǎng)池陣列微流控芯片，同時提出一種單線蟲并行分離的方法，通過考察液體培養(yǎng)時的線蟲密度、線蟲體寬及其分布等影響因素，分析在芯片上進行線蟲進樣和單線蟲并行分離的條件。通過改變無菌液體培養(yǎng)時的線蟲密度，得到不同尺寸的線蟲樣品，比較其對芯片線蟲分離的效果，進一步驗證線蟲樣品的尺寸對單線蟲并行分離的影響。本試驗結(jié)果將為后續(xù)進一步優(yōu)化單線蟲分離條件提供基礎數(shù)據(jù)，并為構(gòu)建自動化單線蟲并行培養(yǎng)和長期觀測微流控分析系統(tǒng)奠定技術(shù)基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秀麗隱桿線蟲株系為野生型線蟲(N2)，購于美國NIH Nation Center for Research Resources(NCRR)資助的線蟲保種中心(CGC, Caenorhabditis Genetics Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN)。

線蟲液體培養(yǎng)基CeMM(C.elegansMaintenance Medium)按文獻中的方法配制而成[11]，主要包括水溶性部分、TEA可溶性部分、氨基酸、核酸取代物(Thymine等)、其他生長因子及能量(D-glucose)。

1.2 線蟲培養(yǎng)與同步化

用蒸餾水將配好的培養(yǎng)基調(diào)整至合適的最終體積，并充分混合，使用0.2 μm醋酸纖維素過濾器過濾。

線蟲擴繁：取1 mL在CeMM中培養(yǎng)的線蟲溶液，加入10 mL 的CeMM液體培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)7 d后，進行線蟲同步化。

線蟲同步化：取3.5 mL線蟲溶液，加入0.5 mL NaOH和NaClO裂解液，處理約5.5 min，期間注意觀察溶液的狀態(tài)，至線蟲溶液變微黃，且肉眼看不到明顯的線蟲殘片。同步化后，用移液槍取部分線蟲卵溶液至載玻片上，在顯微鏡下觀察同步化后的線蟲卵是否完整。

1.3 微流控芯片的設計與加工

1.3.1 微流控芯片結(jié)構(gòu) 用于線蟲分析的培養(yǎng)池陣列微流控芯片結(jié)構(gòu)見圖1，從左至右依次包括并行排列的3個進樣通道和入口、進樣儲液池、若干條線蟲分析通道組成的陣列(本試驗采用含8條線蟲分析通道的結(jié)構(gòu))以及出口處的儲液池和出口。多條線蟲分析通道并行排布，分析通道的兩端分別與進樣儲液池和出口儲液池相連，各分析通道之間互不干擾，可在壓力作用下進行多條單線蟲的并行控制；每條線蟲分析通道由進樣端的錐形線蟲捕獲結(jié)構(gòu)、橢圓形的培養(yǎng)池以及出口端的細通道連接結(jié)構(gòu)組成，具體尺寸見圖1。培養(yǎng)池兩端的線蟲捕獲結(jié)構(gòu)和細通道連接結(jié)構(gòu)的最小寬度由線蟲樣品的尺寸決定，可滿足早期成蟲樣品(體寬大于35 μm)的控制要求，實現(xiàn)線蟲分離及單線蟲控制，從而可進行線蟲樣品的長期培養(yǎng)及觀測分析。微流控芯片通道深度約50 μm，可用于線蟲控制；培養(yǎng)池深度約250 μm，可用于線蟲長期培養(yǎng)及正?；顒樱部蓾M足線蟲樣品視頻監(jiān)測的需求。

圖1 培養(yǎng)池陣列微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of microfluidic chip with an array of culture chambers

1.3.2 微流控芯片加工 所用的微流控芯片采用軟光刻法制備[12-15]，芯片模板為UV光刻法加工的SU-8陽模。PDMS(聚二甲基硅氧烷)芯片采用澆注法制作，單體和固化劑的比例為10∶1，經(jīng)混勻、脫氣、固化(60 ℃×3 h)、脫模和切割、打孔后，將PDMS芯片和預先切割的PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)空白底板封接[16]。試驗前，先用10% 的F-127溶液潤濕整個PDMS/PMMA芯片的通道及培養(yǎng)池，靜置5～10 min后用無菌水將芯片通道清洗干凈，55 ℃烘干，再放置于真空干燥器中抽真空1 h。使用時，將芯片從真空干燥器中取出，吸取適量CeMM培養(yǎng)液浸潤整個芯片通道，無明顯氣泡即可。

1.4 微流控芯片線蟲分離試驗方法

使用3個注射泵(TJ-2A/ L0107-2A，保定蘭格恒流泵有限公司)和聚四氟乙烯(PTFE)塑料管，進行微流控芯片上的流體控制(圖2)，可準確設定流速和體積等參數(shù)。

線蟲經(jīng)同步化處理后，在CeMM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～7 d，在顯微鏡下觀察并測量部分線蟲的體寬。當測量的線蟲樣品大部分(>70%)體寬超過35 μm時，取線蟲懸浮液，清洗掉雜質(zhì)后，調(diào)整線蟲密度約為2000～3 000條/mL，備用。

用含有CeMM培養(yǎng)液的注射器-2和PTFE管抽取10 μL線蟲溶液(約含有線蟲20～30條)，并將該PTFE管插入微流控芯片的入口-2，同時將注射器-1和注射器-3分別接至入口-1和入口-3，隨后按如下流程進行線蟲分離試驗：

線蟲加樣與捕獲：關閉注射泵-1和注射泵-3，開啟注射泵-2，并以150 μL/h的流速推動線蟲樣品進入進樣儲液池，約3～5 min后，部分線蟲被捕獲至錐形結(jié)構(gòu)的細通道處。

清除多余線蟲：斷開注射泵- 2與入口-2的連接管，同時開啟注射泵-1和注射泵-3(流速均為300 μL/h)3～5 min，將進樣儲液池中多余的線蟲從入口-2處清除，并將注射泵-2連接管內(nèi)可能殘留的線蟲排除。

線蟲進樣與分離：將注射泵-1和注射泵-3的流速調(diào)為50 μL/h，同時將注射泵-2與入口-2連接并開啟注射泵-2，采用快推模式將捕獲結(jié)構(gòu)處的線蟲迅速沖入培養(yǎng)池中，實現(xiàn)線蟲的分離。

每一步操作結(jié)束后，在顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。試驗完成后，將微流控芯片中的液體抽吸干凈，隨后用無水乙醇和無菌水清洗通道，放入55 ℃烘箱烘干，備用。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”表示，采用t檢驗分析，P<0.05代表有顯著性差異，P<0.01代表有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

前期研究初步考察了基于微流控芯片的線蟲進樣和分離的基本條件，包括各個步驟的流速、時間和注射泵的狀態(tài)等(詳見試驗方法部分)，發(fā)現(xiàn)線蟲樣品的體寬及其分布對微流控芯片上線蟲的分離效果有顯著影響[14, 17-19]。本試驗主要從影響線蟲體寬及其分布的無菌液體培養(yǎng)條件，即液體培養(yǎng)時的線蟲密度方面，來考察其對線蟲尺寸和芯片上線蟲分離效果的影響。

2.1 不同密度下培養(yǎng)對線蟲體寬的影響

在CeMM液體培養(yǎng)基中馴化的線蟲樣品，經(jīng)同步化處理后，分別采用較高密度(約700 條/mL)和較低密度(約300條/mL)進行無菌液體培養(yǎng)，并定期觀測其尺寸變化。培養(yǎng)6～7 d后，統(tǒng)計線蟲平均體寬，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，在較高密度下進行線蟲無菌液體培養(yǎng)時，得到的線蟲樣品體寬偏小，且尺寸分布較分散(35.5 μm±5.2 μm)。當降低線蟲培養(yǎng)的密度時，得到的線蟲樣品體寬較大，尺寸分布較均勻 (40.0 μm±1.8 μm)，與高密度下培養(yǎng)的線蟲尺寸之間存在顯著性差異，表明密度對線蟲的體寬有明顯影響。

2.2 不同密度下培養(yǎng)的線蟲對芯片上線蟲分離的影響

分別采用高密度和低密度下培養(yǎng)的線蟲樣品，將其稀釋至合適的密度后，每次取20～30條線蟲進行芯片上的分離試驗，每種樣品重復3次。試驗過程中，分別記錄加樣與捕獲階段和清除多余線蟲階段每個捕獲通道處的線蟲數(shù)，以及進樣與分離階段每個培養(yǎng)池中的線蟲數(shù)，并采集相應圖像(圖4)。

圖3 不同培養(yǎng)密度下線蟲體寬分布結(jié)果Fig.3 Distribution of nematode body width under different culturing densities

圖5為高密度與低密度下培養(yǎng)的線蟲樣品在芯片上分離的結(jié)果。經(jīng)統(tǒng)計可知，采用兩種不同的樣品時，在加樣與捕獲階段，含有線蟲的捕獲通道的數(shù)量分別為6.3±0.6和8±0，且兩種樣品間存在顯著性差異；在清除多余線蟲階段，含有線蟲的捕獲通道的數(shù)量分別為5±1和7.3±1.2，統(tǒng)計分析顯示兩種樣品間不存在顯著性差異；在進樣與分離階段，含有線蟲的培養(yǎng)池的數(shù)量分別為4.3±0.6和6.7±0.6，且兩種樣品間存在極顯著性差異，表明線蟲體寬及其分布對芯片上的線蟲分離有明顯影響，具體分析如下。

A.較高密度下培養(yǎng)的線蟲樣品;B.較低密度下培養(yǎng)的線蟲樣品

圖5 不同密度下培養(yǎng)的線蟲進行芯片上分離的統(tǒng)計結(jié)果Fig.5 Experimental results for microfluidic chip-based isolation of C.elegans cultured with different densities

2.2.1 高密度 在高密度下培養(yǎng)的線蟲樣品在加樣與捕獲階段，有1～2個捕獲通道處不含線蟲，且不含線蟲的捕獲通道在芯片上的位置呈隨機分布，其余捕獲通道均含有單條線蟲；在清除多余線蟲階段，有2～4個捕獲通道處不含線蟲，且上一階段捕獲的線蟲易發(fā)生丟失；在進樣與分離階段，有3～4個培養(yǎng)池中不含線蟲，部分線蟲進一步丟失。

在加樣與捕獲階段，線蟲樣品溶液以較低流速(150 μL/h)進入芯片進樣儲液池中，因線蟲體寬差別較大，線蟲隨液流分布在芯片的不同位置，部分較小的線蟲先進入捕獲通道，隨后直接進入培養(yǎng)池；較大的線蟲被捕獲到錐形結(jié)構(gòu)的細通道處，導致該通道的流動阻力增大，從而影響后續(xù)線蟲進入。線蟲捕獲過程結(jié)束后，改變3個注射泵的狀態(tài)，同時以較大流速(300 μL/h)將進樣儲液池中剩余的線蟲全部清除，此時，少數(shù)被捕獲的線蟲因體型較小而被流體帶入進樣儲液池，最后被一起清除。當進樣儲液池中無殘留線蟲后，再次改變注射泵的狀態(tài)，采用注射泵快推模式 (～1 s)，將通道中捕獲的線蟲迅速沖入培養(yǎng)池，減少因線蟲尺寸不一致而導致的運動不同步情況，尺寸較小的線蟲則可被沖出培養(yǎng)池，進入出口端的儲液池。

以上結(jié)果初步驗證了采用含有培養(yǎng)池陣列的微流控芯片進行單線蟲并行分離的可行性(含有單線蟲的培養(yǎng)池數(shù)量占所有培養(yǎng)池的比例約 54.2%)，同時也表明，線蟲并行分離過程受線蟲體寬及其分布的影響較大，需進一步驗證和考察。

2.2.2 低密度 在低密度下培養(yǎng)的線蟲樣品在加樣與捕獲階段，所有捕獲通道處均含有線蟲，其中1～2個通道含有兩條線蟲，且通道位置呈隨機分布，其他通道均含有單條線蟲；在清除多余線蟲階段，僅有個別位置發(fā)生線蟲丟失現(xiàn)象，大部分線蟲仍保持被捕獲狀態(tài)；在進樣與分離階段，出現(xiàn)少數(shù)線蟲丟失情況。在各步試驗操作過程中，因線蟲體寬分布較均勻，明顯改善了線蟲運動的同步性，從而提高芯片上線蟲并行分離的效果(含有線蟲和單線蟲的培養(yǎng)池數(shù)量占所有培養(yǎng)池的比例分別為 83.3%和66.7%)。同時，因線蟲體寬較大，易被捕獲且不易被沖出培養(yǎng)池，當個別通道進入兩條線蟲時，這兩條線蟲均可進入培養(yǎng)池并被保留，導致部分培養(yǎng)池最終含有兩條線蟲(圖6)。進一步改進線蟲加樣與捕獲條件(線蟲尺寸、數(shù)量，注射泵開關狀態(tài)、流速、時間等)，有望降低同一通道捕獲兩條線蟲的比例。為進一步減少被捕獲線蟲的丟失，可詳細考察影響線蟲清除和進樣的因素，并優(yōu)化試驗條件。

3 討論與展望

已有的線蟲在植物和農(nóng)業(yè)方面的研究，如線蟲對植物生長的影響[20]、園藝線蟲防治[21]等，多數(shù)是基于線蟲群體水平的研究，而常規(guī)方法較難實現(xiàn)單線蟲遺傳發(fā)育的縱向研究，在一定程度上影響了結(jié)果的準確性和研究深度。單線蟲水平的研究充分考慮了線蟲的個體差異，可以獲得更豐富、更準確的信息，從而避免群體研究時平均值所帶來的偏差。單線蟲的分離和操控對于單線蟲的研究有很重要的意義。Hulme等[14]設計一種研究線蟲壽命的多通道微流控芯片，成功實現(xiàn)線蟲個體發(fā)育連續(xù)觀察20 d。但該方法需要手動加樣、每次加入單條線蟲，芯片結(jié)構(gòu)和操作過程復雜，難以實現(xiàn)單線蟲自動化并行控制。Kopito等[18]利用微流控芯片記錄單線蟲的產(chǎn)卵數(shù)等指標，但過程中線蟲活動受到限制，無法長期正常生長。Gokce等[22]設計的芯片可以實現(xiàn)單線蟲的固定并進行顯微操作，但線蟲釋放后會造成混合培養(yǎng)，無法實現(xiàn)單線蟲的精確追蹤。Mondal等[19]設計的芯片可以實現(xiàn)大規(guī)模單線蟲分離和高分辨率成像，但難以實現(xiàn)單線蟲長期培養(yǎng)和觀測。Atakan等[23]設計的微流控芯片可以實現(xiàn)8種不同種類單線蟲分離，但難以實現(xiàn)單線蟲長期追蹤，同時線蟲進樣、分離、培養(yǎng)過程需要人為控制和操作。綜上所述，雖然基于微流控技術(shù)的單線蟲分析已有相關報道，但現(xiàn)有芯片結(jié)構(gòu)大多不含有單線蟲培養(yǎng)池，難以實現(xiàn)單線蟲的長期培養(yǎng)和追蹤，且操作繁瑣、不確定性高、自動化程度低，降低了研究結(jié)果的精確性和準確度，極大限制了單線蟲研究的廣度和深度。

圖6 較低密度下培養(yǎng)的線蟲進行芯片分離的結(jié)果Fig.6 Experimental results for microfluidic chip-based isolation of C.elegans cultured with low density

為解決上述問題，本研究設計培養(yǎng)池陣列微流控芯片，其中包含8個并行排列的線蟲分析通道，同時提出單線蟲并行分離的方法，并考察線蟲體寬及其分布對芯片上單線蟲并行分離的影響。通過改變無菌液體培養(yǎng)時的線蟲密度，發(fā)現(xiàn)低密度下(約300條/mL)得到的線蟲樣品，其體寬較大且分布均勻性較好(40.0 μm±1.8 μm)，這可能是因為線蟲生存環(huán)境的優(yōu)化，改善線蟲生長的一致性；同時，該線蟲樣品在芯片上各步操作過程中運動的同步性明顯改善，提高芯片上線蟲捕獲和并行分離的效果(含有線蟲和單線蟲的培養(yǎng)池所占比例分別為83.3%和66.7%)。

本試驗為解決單線蟲的并行分離和控制等問題提供一種可行的方案。進入培養(yǎng)池中的單線蟲可通過定期更換培養(yǎng)液而實現(xiàn)長期培養(yǎng)和觀測，以獲取不同線蟲生長周期更豐富、更完整的單線蟲研究結(jié)果。單線蟲并行分離和控制方法，可同時獲得更多單線蟲的信息，使單線蟲研究結(jié)果具有生物學統(tǒng)計意義。

本試驗提出的單線蟲分析通道陣列可擴展至更大數(shù)量，并可通過對流體的程序控制實現(xiàn)自動化操作，將為基于微流控芯片的單線蟲長期培養(yǎng)、精準刺激、可逆捕獲及熒光成像觀測等提供便利，同時可為微生物源和植物源農(nóng)藥篩選及植物線蟲防治等工作提供技術(shù)支持[24]。