陳冰冰，歐穎儀，葉灝鐸，金昶言，梁興唐，尹艷鎮(zhèn)，鄭韻英，曹 庸，苗建銀,,4,

（1.華南農業(yè)大學食品學院，廣東省功能食品活性物重點實驗室， 廣東廣州 510642；2.廣西農產資源化學與生物技術重點實驗室，廣西玉林 537000；3.北部灣大學石油與化工學院， 欽州市生物廢棄物資源富硒功能化利用重點實驗室，廣西欽州 535011；4.農業(yè)農村部富硒產品開發(fā)與質量控制重點實驗室/富硒食品開發(fā)國家地方聯(lián)合工程實驗室，陜西安康 725000）

高血壓是各種心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的主要病因之一，高血壓患者是世界范圍內患病人群中最大的一個群體，預計到2025年，發(fā)病人數(shù)將超過15億[1-2]。血管緊張素轉化酶（Angiotensin-converting enzyme，ACE）是調節(jié)血壓和血管功能的重要因子。抑制ACE的活性可以有效阻止血管緊張素Ⅱ的生成，從而防治高血壓。常見ACE抑制劑藥物有卡托普利、苯那普利等，但臨床上會有頭痛、疲勞等不良反應[3-4]。尋求安全、無副作用的食源性ACE抑制活性成分成為近年研究的熱點，比如從馬氏珍珠貝肉蛋白[5]、牛乳酪蛋白[6]、大米[7]、龍須菜[8]、核桃[9]、松仁[10]等原料的酶解產物中已發(fā)現(xiàn)具有ACE抑制活性的多肽。

硒（Selenium，Se）是人體、動物體以及多種微生物體中各種重要生物學功能所必需的微量元素[11]，也是許多酶的重要組成部分，具有保護血管、維持心臟正常等功能[12]。研究證實，富硒肽具有抗氧化、降血壓、保肝、免疫調節(jié)等多種生理功能，比如從富硒糙米蛋白水解物中得到了對DPPH自由基、OH自由基和O2-自由基具有強抗氧化活性的硒肽[13]和富硒免疫調節(jié)肽[14]；從富硒螺旋藻[15-16]和富硒茶[17]中分離鑒定出具有抑制ACE活性的硒肽。

辣木（Moringa oleiferaLam.）是一種生長在熱帶和亞熱帶的藥食兩用的植物[18]。2012年11月，我國衛(wèi)生部批準辣木葉為新資源食品[19]，被中國綠色食品發(fā)展中心認定為“國家首推綠色食品”[20]。辣木葉粉中蛋白質含量豐富，高達27.6%～35.4%[21-22]，氨基酸種類多達19種（天冬氨酸、谷氨酸為主）[23]，可媲美大豆，是一種值得開發(fā)利用的優(yōu)質植物蛋白。但是，辣木葉蛋白體外消化率低且多作為動物飼料使用，造成資源的極大浪費[24]。研究表明，辣木葉蛋白及其酶解產物具有抗菌[25]、清除自由基能力和修復氧化損傷[26]以及改善高尿酸血癥和代謝紊亂[27]等功能活性，但關于辣木葉蛋白肽對ACE抑制活性的研究報道較少。將硒的降血壓作用與辣木葉肽的降血壓作用相結合開發(fā)富硒辣木葉低聚肽產品，可能具有更好的降血壓效果，但目前關于富硒辣木葉肽降血壓的效果尚未報道。本研究以富硒辣木葉為原料，通過堿溶酸沉法提取富硒辣木葉蛋白，研究不同蛋白酶以及酶解工藝對于ACE抑制肽的制備及ACE抑制率的影響，采用響應面法明確最佳制備工藝，并對最優(yōu)工藝條件下酶解物的ACE抑制活性、氨基酸組分和硒含量進行分析。本研究為辣木葉蛋白的深入研究提供參考依據(jù)，而且為富硒ACE抑制肽在功能性食品、醫(yī)藥領域的應用提供理論支持，以期促進富硒辣木葉的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

富硒辣木葉粉 由北部灣濱海富硒功能農業(yè)研究院提供；木瓜蛋白酶（20萬U/g）、中性蛋白酶（10萬U/g）、胃蛋白酶（300萬U/g）、胰蛋白酶（25萬U/g） 南寧龐博生物工程有限公司；血管緊張素轉化酶（ACE）、N-[3-（2-呋喃基）丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（N-[3-（2-furyl）acryloyl]-Lphenyalanyl-glycyl-glycine，F(xiàn)APGG）、羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES） 美國Sigma-Aldrich公司；其他化學品和試劑 均為分析純。

2300多功能酶標儀 PerkinElmer公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市華城海龍實驗儀器廠；L530臺式低速自動平衡離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；FD-1型冷凍干燥機 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DH5000BII電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津泰斯特儀器有限公司；pH計 上海佑科儀器有限公司；電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司； AFS-9530原子熒光光度計 北京海光儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 富硒辣木葉蛋白的提取 基于堿溶酸沉原理，參考祝素瑩等[28]方法提取富硒辣木葉蛋白，并進行部分改進。稱取一定量富硒辣木葉粉，用0.01 mol/L NaOH溶液配成辣木葉粉溶液（料液比1:20）在45 ℃條件下水浴3 h后，4000 r/min下離心10 min，收集上清液。用HCl調整pH至4.5，室溫靜置10～20 min，4000 r/min下，棄上清得到蛋白質沉淀，-40 ℃冷凍干燥24 h后即得富硒辣木葉蛋白粉。

1.2.2 富硒辣木葉蛋白ACE抑制肽的制備 參考趙爽等[29]的方法并略作修改。以ACE抑制活性為指標，將富硒辣木葉蛋白粉加入蒸餾水配制成一定濃度的蛋白質溶液，調節(jié)pH，加入一定量的酶，恒溫水浴搖床酶解3 h后于沸水浴滅酶10 min，冷卻至室溫，4000 r/min下離心20 min，上清液即為含ACE抑制肽的酶解液。

1.2.3 單因素實驗 選取4種蛋白酶并在其最適的條件下對富硒辣木葉蛋白進行酶解，分別為木瓜蛋白酶（pH6.5，55 ℃）、中性蛋白酶（pH7，45 ℃）、胃蛋白酶（pH2，37 ℃）、胰蛋白酶（pH8，37 ℃）。在底物濃度為3%，酶底比為0.3%，酶解3 h，滅酶，離心，取酶解液測定ACE的抑制率，選擇合適的蛋白酶。

單因素基礎條件設為：酶解溫度3 h，pH8，底物濃度3%和酶底比0.3%。在最適酶的基礎上，其他單因素實驗采用改變一個因素，固定其他因素不變的方式，分別探究酶解溫度（27、32、37、42、47 ℃），pH（7、7.5、8、8.5、9），底物濃度（1%、3%、5%、7%）和酶底比（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）對酶解物ACE抑制活性的影響。

1.2.4 響應面優(yōu)化試驗 在單因素實驗的基礎上，以底物濃度（A）、酶底比（B）和溫度（C）三個因素為自變量，以ACE抑制率為響應值，選擇Design-Expert V8.0.6.1軟件的Box-Behnken設計并進行三因素三水平的響應面試驗，確定酶解富硒辣木葉蛋白的最優(yōu)工藝條件。響應面因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.5 ACE抑制率的測定 采用FAPGG法測定ACE抑制率[30]。緩沖液和反應物分別為80 mmol/L pH8.3的HEPES-NaOH（含0.3 mol/L NaCl）和緩沖液配制的1 mmol/L FAPGG。將酶解液用超純水稀釋30倍，在酶標板孔中依次加入40 μL待測樣品、50 μL底物和10 μL ACE溶液（0.1 U/mL），振蕩10 s后，快速放入酶標儀中測定340 nm下的吸光度，記為A1，而后37 ℃孵育30 min后測定吸光值為A2。計算ΔA，ΔA = A1-A2，以單位時間內吸光度值的變化表ACE酶活性。以緩沖液代替待測樣品作空白對照。按照式（1）計算ACE抑制率：

式（1）中：ΔAb為加入緩沖液時吸光度在30 min內的變化；ΔAa為加入抑制劑時吸光度在30 min內的變化。

1.2.6 最優(yōu)酶解物ACE抑制活性測定 將最優(yōu)酶解條件下的上清液冷凍干燥后，使用HEPES緩沖液（pH8.3）配制成不同濃度樣品溶液（0.1、0.25、0.5、1、2 mg/mL），測定ACE抑制率。IC50定義為ACE抑制率達50%時的多肽質量濃度（mg/mL），用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件的概率單位法計算。

1.2.7 氨基酸組成測定 將最優(yōu)酶解條件下制備的富硒辣木葉ACE抑制肽冷凍干燥，獲得的凍干粉即為測定樣品。參照GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》，以外標法檢測樣品液中17種氨基酸的濃度[31]。

1.2.8 硒含量的測定 根據(jù)國家標準GB 5009.93-2017《食品中硒的測定》，采用氫化物原子熒光光譜法（HG-AFS）測定富硒辣木葉原料，富硒辣木葉提取蛋白和富硒辣木葉ACE抑制肽中的總硒含量[32]。稱取適量樣品置于錐形瓶中，用10 mL濃硝酸和高氯酸混合物（v/v，9:1）在150 ℃下消化2.5 h，冷卻后，加入5 mL 6 mol/L鹽酸將樣品中六價硒還原成四價硒。冷卻后，用超純水將消化后的溶液稀釋至25 mL，然后將10 mL的溶液轉移到反應容器中，其中加入2 mL 6 mol/L鹽酸和1 mL 10% （w/w）鐵氰化鉀，混勻待測，同時做空白對照。

儀器條件為：負高壓280 V，硒燈電流80 mA，原子化器高度8 mm，載氣流量為300 mL/min；屏蔽氣流量為800 mL/min，讀數(shù)時間12 s，延遲時間3 s，重復測定3次，測定樣品硒含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準偏差表示，采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件，多組數(shù)據(jù)間進行單因素方差分析（One-AVOVA中的Duncan’s test）。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 蛋白酶的篩選 由于不同種類蛋白酶的作用位點不同，酶解獲得的多肽片段也不相同，表現(xiàn)出的體外ACE抑制活性存在差異[28]。由圖1可知，在各自適宜的條件下，不同蛋白酶酶解物對ACE抑制活性有顯著的影響（P＜0.05），ACE抑制率由高到低依次為胰蛋白酶（78.01%）＞中性蛋白酶（47.64%）＞胃蛋白酶（43.46%）＞木瓜蛋白酶（24.61%）。這說明富硒辣木葉蛋白結構更適宜胰蛋白酶發(fā)揮作用，能夠有效釋放更多目標肽段，后續(xù)實驗采用胰蛋白酶為ACE抑制肽制備酶。Sun等[33]報道，經胰蛋白酶水解的黃斑海蜇蛋白顯示出最強的ACE抑制活性。余虹等[8]也發(fā)現(xiàn)經胰蛋白酶水解的龍須菜蛋白水解物對ACE的抑制能力最強。據(jù)報道，C末端Arg或Lys的存在能增強ACE抑制效價[34-36]，由于胰蛋白酶其酶切位點優(yōu)先在精氨酸和賴氨酸處裂解，因此胰蛋白酶水解產生的肽段C末端位置為精氨酸或賴氨酸，這可能是其酶解肽段活性較強的原因。

圖1 蛋白酶種類對酶解物ACE抑制率的影響Fig.1 Effects of protease species on ACE inhibitory activity of enzymatic hydrolysates

2.1.2 酶解溫度對酶解效果的影響 由圖2可知，在其他因素固定不變的條件下，酶解溫度對ACE抑制活性有顯著的影響（P＜0.05），隨著酶解溫度的升高，ACE抑制率先增加后降低，酶解溫度為37 ℃時，ACE抑制率達到最大值79.49%?？赡苡捎诖藭r酶活性較高，能更有效地水解蛋白質，釋放具有抑制ACE活性的肽分子，當溫度繼續(xù)升高時，可能影響蛋白酶活性，進而使ACE抑制率降低[37-38]，因此選用ACE抑制效果最佳的37 ℃進行后續(xù)實驗。

圖2 酶解溫度對ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on ACE inhibitory activity

圖3p H對ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of pH on ACE inhibitory activity

2.1.3p H對酶解效果的影響 由圖3可知，pH對富硒辣木葉肽的ACE抑制活性影響呈先升后降的趨勢，在pH7.5處達到最高值（84.56%，P＜0.05）后逐漸下降。pH是影響酶解效果的重要因素，它的影響體現(xiàn)在蛋白酶構象、酶與蛋白質的結合狀態(tài)等方面，pH過高或過低都不利于更好的酶解效果[39-40]。在對魔芋ACE抑制肽[41]和榛子粕ACE抑制肽[42]等研究中也觀察到類似變化，隨著pH變化所呈現(xiàn)的先升后降的趨勢與此吻合。因此，確定最適pH為7.5。

2.1.4 底物濃度對酶解效果的影響 由圖4可知，底物濃度對ACE抑制活性有顯著的影響（P＜0.05），在考察底物濃度范圍內，酶解產物ACE抑制活性呈先上升后下降的趨勢。當酶解底物濃度為5%時，酶解得到的富硒辣木葉多肽產物具有最高的ACE抑制活性，為84.65%。當?shù)孜餄舛壤^續(xù)增大，抑制率反而降低，一方面可能沒有足夠的酶催化底物反應，另一方面酶解液過于粘稠，影響蛋白質的自由擴散，影響酶解效率[42-43]。最終選取底物濃度5%為最佳反應條件。

圖4 底物濃度對ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on ACE inhibitory activity

2.1.5 酶底比對酶解效果的影響 如圖5所示，酶底比對ACE抑制活性有顯著的影響（P＜0.05），酶解產物的ACE抑制活性呈先增強后減弱的趨勢，當酶底比為0.3%時，ACE抑制率達到最大，為77.18%，后再增加酶用量，ACE抑制活性下降，可能是過量的蛋白酶將具有活性的多肽繼續(xù)降解為活性低甚至無活性的小肽，而且還會造成不同程度的資源浪費[44-46]。因此在進行酶底比的選擇時，不僅要求考慮其對酶解效果的影響，還需考慮資源浪費和經濟成本等方面。因此，最佳酶解酶底比為0.3%。

圖5 酶底比對ACE抑制率的影響Fig.5 Effect of enzyme/substrate on ACE inhibitory activity

2.2 響應面試驗

2.2.1 Box-Benhnken試驗設計及結果 在單因素基礎上，以底物濃度（A）、酶底比（B）和溫度（C）三個因素為自變量，以ACE抑制率為響應值，利用利用Box-Behnken中心組合試驗進行三因素三水平試驗，對酶解條件進行優(yōu)化。響應面試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 響應面設計方案及結果Table 2 Design and results of the response surface experiment

表3 響應面二次模型方差分析Table 3 Analysis of variance for response surface quadratic model

2.2.2 回歸方程的建立與檢驗 利用軟件（Design Expert V 8.0.6.1）對表2的實驗結果進行擬合，得到二次多項回歸方程：Y=87.44+3.95A-1.02B+2.28C-5.57AB-0.18AC+0.65BC-8.30A2-2.30B2-1.94C2。

對擬合出的回歸模型進行顯著性檢驗（見表3），該模型的F值為4.33，P=0.0331＜0.05，表明該模型較顯著，失擬項P=0.0548＞0.05，不顯著。說明未知因素對試驗結果的影響較小；即該模型在被研究的整個回歸區(qū)域內擬合較好，可用于預測酶解產物的ACE抑制率，所得二次回歸方程可用于擬合三個參數(shù)和響應值間的關系[47-48]。

觀察單個變量以及變量間兩兩組合的P值，發(fā)現(xiàn)單個變量中底物濃度對響應值的影響最為顯著，酶底比及溫度對響應值的影響不顯著；根據(jù)P值推測三個因素對酶解液ACE抑制率的影響程度為：底物濃度＞溫度＞酶底比。二次項中AB的P=0.0294＜0.05，說明底物濃度和酶底比間的交互作用對ACE抑制率存在顯著影響。變異系數(shù)（Coefficient of Variance，CV）反映模型的置信度，CV值越低模型的置信度越高[49]；當變異系數(shù)＜10%時，模型是可靠的[50]，本實驗的CV值為5%，說明模型方程能夠很好地反映真實的實驗值。綜上，本實驗所得出的模型有較好的可靠性，可以應用于后續(xù)的預測之中。響應面交互作用（圖6～圖8）結果表明，AB對抑制率的影響顯著，其他因素交互作用不顯著。

圖6 底物濃度和酶底比對ACE抑制率影響的響應面圖Fig.6 Response surface diagram of the influence of substrate concentration and enzyme/substrate on ACE inhibitory activity

圖8 酶底比和溫度對ACE抑制率影響的響應面圖Fig.8 Response surface diagram of the influence of enzyme/substrate and hydrolysis temperature on ACE inhibitory activity

通過Design-Expert V 8.0.6.1軟件分析及預測，得到胰蛋白酶酶解富硒辣木葉蛋白制備ACE抑制肽的最佳工藝參數(shù)：底物濃度5.97%、酶底比0.23%、溫度39.2 ℃。對最優(yōu)工藝進行驗證，將酶解參數(shù)設定為底物濃度5.97%、酶底比0.23%、溫度39.2 ℃，酶解時間3 h，pH7.5，酶解產物的實際ACE抑制率為88.97%，接近預測值89.27%，說明該回歸模型對試驗結果的分析預測準確。

圖7 底物濃度和溫度對ACE抑制率影響的響應面圖Fig.7 Response surface diagram of the influence of substrate concentration and hydrolysis temperature on ACE inhibitory activity

2.3 富硒辣木葉蛋白肽ACE抑制活性分析

圖9可見，ACE抑制率與樣品的濃度呈現(xiàn)正相關關系，濃度的升高會提高ACE抑制率，呈現(xiàn)劑量依賴性。在樣品溶液濃度為0.5 mg/mL時，ACE抑制率已經超過50%；在濃度達到2 mg/mL時，ACE抑制率達到了65.98%；利用SPSS軟件得到該條件下富硒辣木葉ACE抑制肽的IC50為0.522 mg/mL。封張萍等[51]通過胰蛋白酶水解大米蛋白制備ACE抑制肽，測得經大孔樹脂吸附后大米ACE抑制肽的IC50值為1.571 mg/mL。Wang等[52]用響應面法優(yōu)化毛蝦的發(fā)酵工藝，檢測所得到發(fā)酵產物的ACE抑制能力，在最優(yōu)發(fā)酵條件下發(fā)酵產物的IC50值為3.370 mg/mL。綜上，酶解制備的富硒辣木葉蛋白ACE抑制肽在還未進行進一步分離純化時便具有較好的ACE抑制能力，預計后續(xù)通過進一步篩選可以得到ACE抑制效果更好的單體。

圖9 不同濃度酶解物的ACE抑制率Fig.9 ACE inhibitory activity of enzymatic hydrolysates at different concentrations

2.4 氨基酸組成分析

富硒辣木葉蛋白酶解物的氨基酸組成見表4。在17種氨基酸中有7種人體必需氨基酸，占比為24.05%。單種氨基酸谷氨酸含量最多，占比7.89%，其次為占比6.31%的天冬氨酸，這一結果和大蒜降壓肽[31]以及魚類和貝類的降壓肽[53-54]中的結果相似。此外，研究表明降血壓肽分子中的疏水性氨基酸較為重要，其側鏈可與ACE受體緊密結合，因而ACE抑制活性較強[55-56]。Miyoshi等[57]研究表明，ACE傾向于與含有疏水性氨基酸的底物結合。另外組成多肽的氨基酸親疏水性和多肽的立體化學構象影響其ACE抑制肽的活性，這是受到ACE的C端結構域為疏水性環(huán)境所影響的[58]；并且多肽中疏水性氨基酸的含量以及所在位置對多肽的空間結構也會存在影響，因此疏水性氨基酸的含量會對ACE抑制肽的活性造成重大影響[59]。實驗分析也表明，富硒辣木葉蛋白酶解物的疏水性氨基酸含量較高，達20.6%，這與其較高的ACE抑制活性具有密切聯(lián)系。

表4 富硒辣木葉蛋白酶解物的氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of Se-enriched M. oleifera leaves protein hydrolysate

2.5 硒含量分析

由表5可知，富硒辣木葉原料，富硒辣木葉提取蛋白和富硒辣木葉ACE抑制肽中硒含量分別為9.84、16.32、18.31 mg/kg。這一結果說明富硒辣木葉中的硒元素主要與蛋白結合，并且酶解工藝優(yōu)化研究使硒含量在活性肽中進一步富集。與其他富硒產品相比，辣木葉中的硒含量是一些富硒大米的58倍[60]，辣木葉蛋白的硒含量是富硒玉米籽蛋白的2倍[61]，且富硒辣木葉肽的硒含量是富硒大米肽的7.8倍[62]，表明富硒辣木葉是一種硒含量較高的植物資源。有關研究發(fā)現(xiàn)，硒可以通過直接清除氧自由基、構成谷胱甘肽過氧化物酶、保護血管內皮細胞等機制防治高血壓與冠心病[12]，所以硒的含量也可能是影響酶解產物ACE抑制活性的重要因素之一。因此硒蛋白及其原料辣木葉粉制備的含硒ACE抑制肽將是辣木葉中極具開發(fā)潛力的含硒生物活性物質。

表5 不同樣品的硒含量Table 5 Se content of different samples

3 結論

通過堿溶酸沉法提取制備富硒辣木葉蛋白，在單因素實驗基礎上，采用響應面設計進行試驗優(yōu)化，確定胰蛋白酶酶解富硒辣木葉蛋白制備ACE抑制肽的最佳工藝條件為：pH7.5、底物濃度5.97%、酶底比0.23%、溫度39.2 ℃，酶解時間3 h，此時ACE抑制率為88.97%。并對最優(yōu)酶解條件下得到的酶解液凍干粉進行體外ACE抑制率測定，結果顯示富硒辣木葉蛋白酶解物具有較強的ACE抑制能力（IC50=0.522 mg/mL）；氨基酸分析結果表明，該酶解物的天冬氨酸、谷氨酸含量及疏水性氨基酸含量豐富；同時富硒辣木葉蛋白制備的ACE抑制肽的硒含量豐富（18.31 mg/kg）。本研究為富硒辣木葉在相關功能性食品領域的開發(fā)提供了理論依據(jù)。