徐雙麗 孫 偉 韓文杰 史有奎 殷 亮 （山東省濰坊市濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，濰坊 261000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種急性、彌漫性肺損傷危重疾病，嚴(yán)重威脅人類生命健康，其主要由內(nèi)、外致病因素所致，臨床上病死率超過40%［1］。ALI的主要臨床特點為呼吸窘迫、非心源性肺水腫及難治性低氧血癥［2］。ALI的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚無明確的臨床研究報道。即便近年關(guān)于ALI的治療研究較多（一般在糖皮質(zhì)激素、氧自由基清除劑和肺泡表明活性等方面），但其病死率并未得到顯著改善［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)失控是ALI發(fā)生發(fā)展的主要原因［4］。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）可調(diào)節(jié)肺損傷時肺組織內(nèi)的細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子等炎癥因子［5］。IKKα是IKK復(fù)合體的一個催化亞基，IKK復(fù)合體又是NF-κB信號上游的主要成分［6］。外界信號經(jīng)復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激下，會激活I(lǐng)KK復(fù)合體，活化NF-κB，活化的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而調(diào)節(jié)各種基因表達(dá)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞活性等生物過程［7］。桑色素是一種天然的生物活性物質(zhì)，其化學(xué)名稱為（3，5，7，2′，4′-五羥黃酮），屬黃體酮類化合物，其結(jié)構(gòu)特點是含氧的雜環(huán)連接兩個芳香環(huán)［8］。桑色素的主要化學(xué)成分黃體酮類化合物可抑制酶活性，具有抗癌、抗菌、抗炎、降低血糖和抗氧化應(yīng)激等作用，但桑色素對ALI的作用及機(jī)制尚不明確，因此本文建立ALI大鼠模型，探究桑色素對ALI大鼠免疫功能、肺組織病理及IKKα蛋白水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8周齡清潔級SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量180～200 g，購自河南省實驗動物中心［SCXK（豫）2005-0001］。適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠1周，飼養(yǎng)期間使飼養(yǎng)環(huán)境保持在25 ℃、12 h光暗交替循環(huán)。30只大鼠均為普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食攝水。

1.1.2 主要試劑與儀器 桑色素藥物溶液（美國Sigma公司）；NF-κB抗體、IKKα抗體（美國Santa Cruz公司）；DG Spin離心機(jī)（美國Thermo公司）；FYL-YS-150烤箱（中國宏展儀器工業(yè)股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及ALI模型制備 30只大鼠分為正常組（NC組）、ALI大鼠模型組（ALI組）、ALI大鼠模型給予桑色素干預(yù)組（Morin組），每組10只。采用脂多糖氣管滴注法將ALI組和Morin組大鼠制備成ALI大鼠模型。脂多糖以生理鹽水配制成1 mg/ml的溶液，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉兩組大鼠，沿大鼠頸部中線將頸部切開一小口，使氣管充分暴露在外，將1 ml注射器緩慢插入氣管，緩慢滴入脂多糖溶液，以每千克大鼠5 ml計量，NC組大鼠緩慢滴入等量生理鹽水。馬上將3組大鼠垂直并輕輕旋轉(zhuǎn)1 min，使脂多糖在大鼠體內(nèi)均勻分散。

1.2.2 藥物干預(yù) 造模后30 min，Morin組大鼠經(jīng)腹腔注射桑色素干預(yù)治療，每千克大鼠給予40 mg桑色素；NC組和ALI組大鼠均腹腔注射等量生理鹽水干預(yù)治療，三組大鼠各干預(yù)7 d，然后處死大鼠，收集相關(guān)標(biāo)本。

1.2.3 肺組織濕/干重比（W/D）和含水量測定 處死三組大鼠，分別分離三組大鼠肺組織，取出左肺，用干凈濾紙將表面水分吸干，稱取左肺濕重；用錫紙包裹左肺，60 ℃恒溫箱烘烤48 h，至質(zhì)量不再減少時，再次稱量干重，計算W/D和肺含水量。

1.2.4 抗氧化指標(biāo)檢測 分別取三組大鼠動脈血，以3 000 r/min離心10 min。取上層血清，測定血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。

1.2.5 血清中IL-1β和IL-18測定 麻醉各組大鼠后，取大鼠動脈血，在25 ℃環(huán)境中將血清靜置2 h。以3 000 r/min離心30 min。取上層血清，ELISA法測定血清中炎癥因子IL-1β和IL-18水平。

1.2.6 動脈血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的檢測 麻醉大鼠后，分別取三組大鼠腹主動脈血2 ml，將血液用EDTA抗凝后，各組取出60 μl血液至流式細(xì)胞儀，檢測血液中T細(xì)胞亞群中的免疫因子 CD4+、CD8+細(xì)胞百分比和 CD4+/CD8+。

1.2.7 肺組織形態(tài)學(xué)變化 分別麻醉并處死三組大鼠，取各組大鼠肺組織，再將左肺上葉組織取出一小塊置于甲醛中固定，48 h后取出組織，石蠟包埋，用切片機(jī)將石蠟組織切成5 μm薄片，每組任選3張薄片進(jìn)行HE染色，最后用顯微鏡觀察組織形態(tài)學(xué)改變。

對三組大鼠肺組織損傷情況進(jìn)行評分，0分為肺組織未發(fā)生病變；1分為肺組織發(fā)生輕微病變；2分為中度病變；3分為重度病變；4分為極重度病變。

1.2.8 Westren blot檢測肺組織中IKKα和NF-κB p65蛋白表達(dá) 分別取三組大鼠肺組織50 μg，提取肺組織中的總蛋白，蛋白濃度以BCA法檢測。各組取等量蛋白進(jìn)行電泳。將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以脫脂奶粉封閉1 h后加入IKKα和NF-κB一抗，將組織在4 ℃環(huán)境中孵育過夜；加入二抗后繼續(xù)孵育1 h后ECL顯色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS15.0軟件分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)，以±s比較三組間數(shù)據(jù)；三組間比較選用三因素方差進(jìn)行分析；兩組間比較選用t檢驗；以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織W/D和含水量比較 與NC組大鼠相比，ALI組大鼠肺組織W/D及含水量均顯著升高（P＜0.05）；干預(yù)后的Morin組較ALI組肺組織W/D和肺含水量明顯降低（P＜0.05，表1、圖1）。

圖1 各組大鼠W/D和含水量比較Fig.1 Comparison of W/D and water content of rats in each group

表1 各組大鼠W/D和含水量比較（±s）Tab.1 Comparison of W/D and water content of rats in each group （±s）

表1 各組大鼠W/D和含水量比較（±s）Tab.1 Comparison of W/D and water content of rats in each group （±s）

Note：Compared with NC group， 1）P＜0.05； compared with ALI group，2）P＜0.05.

Groups NC ALI Morin F P n 10 10 10 W/D 1.97±0.72 5.51±1.081）3.12±0.821）2）41.5＜0.001 Lung water content（%）68.8±10.5 85.6±12.41）73.1±13.21）2）5.214 0.012

2.2 各組大鼠SOD活性和MDA含量比較 ALI組SOD活性較NC組明顯降低，MDA含量較NC組明顯升高（P＜0.05）；干預(yù)后Morin組大鼠氧化指標(biāo)明顯改善，SOD活性升高，MDA含量降低（P＜0.05），見表2、圖2。

圖2 各組大鼠血清中SOD活性和MDA含量比較Fig.2 Comparison of SOD activity and MDA content in serum of rats in each group

表2 各組大鼠血清中SOD活性和MDA含量比較（±s）Tab.2 Comparison of SOD activity and MDA content in serum of rats in each group （±s）

表2 各組大鼠血清中SOD活性和MDA含量比較（±s）Tab.2 Comparison of SOD activity and MDA content in serum of rats in each group （±s）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05； compared with ALI group，2）P＜0.05.

Groups NC ALI Morin F P n 10 10 10 SOD/（U·mg-1）198.13±40.11 74.52±24.411）175.76±38.181）2）35.54＜0.000 1 MDA/（nmol·mg-1）4.25±1.65 11.28±2.141）5.70±1.111）2）48.55＜0.000 1

2.3 各組大鼠血清中IL-1β和IL-18水平比較 與NC組相比，ALI組血清中炎癥因子IL-1β和IL-18水平均顯著升高（P＜0.05）；干預(yù)后的Morin組大鼠較ALI組大鼠血清中IL-1β和IL-18水平明顯降低，見表3、圖3。

圖3 各組大鼠血清中IL-1β和IL-18水平比較Fig.3 Comparison of IL-1β and IL-18 levels in serum of rats in each group

表3 各組大鼠血清中IL-1β和IL-18水平比較（±s，pg/ml）Tab.3 Comparison of IL-1β and IL-18 levels in serum of rats in each group （±s，pg/ml）

表3 各組大鼠血清中IL-1β和IL-18水平比較（±s，pg/ml）Tab.3 Comparison of IL-1β and IL-18 levels in serum of rats in each group （±s，pg/ml）

Note：Compared with NC group， 1）P＜0.05； compared with ALI group，2）P＜0.05.

Groups NC ALI Morin F P n 10 10 10 IL-1β 22.41±6.56 42.88±9.641）31.36±9.031）2）14.76＜0.000 1 IL-18 137.50±59.71 436.25±136.171）250.12±73.481）2）24.83＜0.000 1

2.4 動脈血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較 與NC組相比，ALI組CD4+、CD4+/CD8+明顯降低，CD8+明顯升高（P＜0.05）；和ALI組相比，Morin組CD4+、CD4+/CD8+明顯升高，CD8+明顯降低（P＜0.05），見表4、圖4。

圖4 各組大鼠動脈血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較Fig.4 Comparison of CD4+， CD8+， CD4+/CD8+T lymphocyte subsets in arterial blood of rats in each group

表4 各組大鼠動脈血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較（±s）Tab.4 Comparison of CD4+， CD8+， CD4+/CD8+T lymphocyte subsets in arterial blood of rats in each group（±s）

表4 各組大鼠動脈血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較（±s）Tab.4 Comparison of CD4+， CD8+， CD4+/CD8+T lymphocyte subsets in arterial blood of rats in each group（±s）

Note：Compared with NC group， 1）P＜0.05； compared with ALI group，2）P＜0.05.

Groups NC ALI Morin F P n 10 10 10 CD4+（%）52.01±2.73 34.22±3.19 49.37±1.84 131.6＜0.000 1 CD8+（%）22.23±0.83 27.81±0.841）22.75±1.041）2）115.1＜0.000 1 CD4+/CD8+2.34±0.15 1.23±0.161）2.18±0.151）2）153.0＜0.000 1

2.5 各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化 NC組肺泡組織完整，肺損傷評分為0分；與NC組相比，ALI組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂且被破壞，肺泡腔被壓縮、變窄，大量肺泡萎陷，泡壁增厚、斷裂，有大量炎癥細(xì)胞、液體的滲出及紅細(xì)胞漏出，間質(zhì)可見出血、水腫，肺損傷評分為10.38±1.31，較NC組明顯升高；與ALI組相比，Morin組肺組織得到明顯改善，其肺損傷評分（3.75±0.71）也明顯降低，見圖5。

圖5 各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化（HE染色，×200）Fig.5 Morphological changes of lung tissue in rats of each group （HE staining， ×200）

2.6 各組大鼠肺組織中IKKα和NF-κB p65蛋白表達(dá)比較 與NC組相比，ALI組IKKα和NF-κB p65蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）；與 ALI組相比，Morin組大鼠肺組織中IKKα和NF-κB p65蛋白明顯降低（P＜0.05），見表5、圖6。

表5 各組大鼠肺組織中IKKα和NF-κB p65蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.5 Comparison of IKKα and NF-κB p65 protein expressions in lung tissue of rats in each group （±s）

表5 各組大鼠肺組織中IKKα和NF-κB p65蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.5 Comparison of IKKα and NF-κB p65 protein expressions in lung tissue of rats in each group （±s）

Note：Compared with NC group， 1）P＜0.05； compared with ALI group，2）P＜0.05.

Groups NC ALI Morin F P n 10 10 10 NF-κB p65 0.61±0.11 1.02±0.141）0.64±0.081）2）41.13＜0.0001 IKKα 0.41±0.09 0.69±0.111）0.49±0.081）2）23.46＜0.0001

圖6 各組大鼠肺組織中IKKα和NF-κB p65蛋白表達(dá)Fig.6 IKKα and NF-κB p65 protein expressions in lung tissue of rats in each group

3 討論

ALI是以肺內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤和滲出、肺泡毛細(xì)血管通透性增加為主要特征的肺部炎癥綜合反應(yīng)，嚴(yán)重的ALI可導(dǎo)致進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭，病死率逐年增加［9］。雖然目前臨床上針對ALI治療的研究很多，但能有效治療肺損傷的藥物仍然較少。桑色素是一種天然化合物，普遍存在于中草藥和膳食中，如桑椹、綠茶、橙子和菠蘿蜜等均可食用。LEE等［10］研究表明，桑色素可減弱IL-1β表達(dá)，抑制炎癥介質(zhì)和促炎細(xì)胞因子釋放。NIE等［11］研究表明，桑色素可通過抑制miR-188-5p表達(dá)抑制cml細(xì)胞增殖，同時促進(jìn)cml細(xì)胞凋亡。目前，桑色素對ALI大鼠的作用鮮有報道。

脂多糖是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁最重要的成分之一，當(dāng)大鼠肺內(nèi)滴入脂多糖時，大鼠炎癥增多，肺組織通透性隨之改變，通常采用脂多糖制備ALI大鼠動物模型［12］。肺毛細(xì)血管的通透性會隨肺損傷的發(fā)生而增加，同時使炎癥遞質(zhì)和炎癥蛋白均進(jìn)入肺泡和肺間質(zhì)；肺泡上皮細(xì)胞會被炎癥因子損傷，進(jìn)而減少肺泡表面的活性物質(zhì)，增加其表面張力，使肺泡毛細(xì)血管中的液體向肺泡內(nèi)濾出，進(jìn)而加重肺水腫［13］。本研究顯示，ALI組大鼠肺泡腔內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤，滲出大量紅細(xì)胞，肺泡間質(zhì)增生嚴(yán)重，肺損傷較NC組明顯加重，提示ALI大鼠模型制備成功。實驗結(jié)果顯示，ALI組大鼠肺組織W/D和肺含水量較NC組顯著增加；經(jīng)桑色素干預(yù)后的Morin組大鼠肺組織W/D和肺含水量明顯降低，提示桑色素對肺水腫具有明顯的治療效果。WANG等［14］通過脂多糖誘導(dǎo)小鼠肺損傷的研究發(fā)現(xiàn)，燈盞花素可有效改善肺損傷，其可能通過抑制小鼠體內(nèi)COX-2/NLRP3/NF-κB信號通路實現(xiàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)給予桑色素干預(yù)后Morin組大鼠氧化指標(biāo)明顯改善，SOD活性升高，MDA含量降低。表明桑色素具有抗氧化能力，可降低氧化應(yīng)激造成的損傷［15］。SOD活性和MDA含量可間接反應(yīng)機(jī)體氧化應(yīng)激損傷程度，肺損傷后機(jī)體活性氧表達(dá)上調(diào)，加快MDA表達(dá)，SOD活性降低，打破氧化抗氧平衡。肺臟本身有抗氧化系統(tǒng)，SOD具有抗氧化能力，當(dāng)肺部受到損傷后，SOD表達(dá)下調(diào)，MDA表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞毒性增加，肺部生物膜及肺功能損傷加重。楊玲等［16］研究表明，桑色素可提高斑馬魚胚SOD活性，降低自由基表達(dá)，從而對受損的斑馬魚胚胎發(fā)揮保護(hù)作用，提示桑色素具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

T淋巴細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)的分布情況可反映機(jī)體細(xì)胞的免疫功能，T淋巴細(xì)胞表面的共同標(biāo)志物為CD3+，CD3+代表T淋巴細(xì)胞的總數(shù)；CD4+可將T細(xì)胞誘導(dǎo)為效應(yīng)細(xì)胞，其是Ti/Th表面的標(biāo)志物；抑制性T細(xì)胞通常以CD8+表示，可溶解病原體感染的自身細(xì)胞［17］。機(jī)體內(nèi)的免疫功能是否穩(wěn)定可用CD4+/CD8+反映，CD4+/CD8+在正常哺乳動物中為2，當(dāng)比值＜2時說明免疫功能被破壞。本研究結(jié)果顯示，ALI組大鼠免疫指標(biāo)較NC組明顯降低；干預(yù)后的Morin 組和 ALI組相比，CD4+、CD4+/CD8+明顯升高，CD8+明顯降低，提示使用桑色素治療后能進(jìn)一步加強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞的免疫功能。鄭紅麗等［18］研究發(fā)現(xiàn)，ALI患者治療后血清中T細(xì)胞分化亞群指標(biāo)明顯優(yōu)于治療前，可見治療后患者體內(nèi)免疫功能得到改善，進(jìn)而減輕了炎癥所致的臟器損傷。桑色素中的生物類黃酮抗炎機(jī)制在于其抑制了前列腺素生物合成過程中的脂氧化酶、蛋白激酶C等，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過程中內(nèi)皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞活性，其可通過影響細(xì)胞的分泌過程、有絲分裂及細(xì)胞間的相互作用發(fā)揮抗炎作用，抑制大鼠肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞對多種刺激引起的組胺及慢反應(yīng)物質(zhì)的釋放，抑制PGE2、白三烯的合成和釋放及透明質(zhì)酸酶活性，降低大鼠中性粒細(xì)胞溶酶體酶的釋放及脫顆粒。有文獻(xiàn)提出，桑色素可介導(dǎo)機(jī)體中Th17/Treg平衡，對固有免疫有一定的調(diào)節(jié)作用［19］。

ALI的病理特征為進(jìn)行性炎癥失控，可導(dǎo)致肺巨噬細(xì)胞焦亡，進(jìn)而釋放促炎因子IL-1β和IL-18，在ALI中，炎癥的過度反應(yīng)占據(jù)主導(dǎo)作用［20］。本研究結(jié)果顯示，ALI組血清中炎癥因子水平均高于NC組；桑色素干預(yù)后的Morin組炎癥因子水平受到明顯抑制。眾多炎癥遞質(zhì)通過不同信號通路作用于巨噬細(xì)胞等不同的效應(yīng)細(xì)胞，嚴(yán)重影響ALI的炎癥反應(yīng)，如NF-κB/IKKα表達(dá)等。目前研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號通路主要由轉(zhuǎn)錄因子、7個抑制蛋白和IκB激酶復(fù)合物組成，其中轉(zhuǎn)錄因子包括p50、p56等，IκB激酶復(fù)合物包括IKKα、IKKβ等［21］。細(xì)胞在經(jīng)典通路中受到刺激后，會激活NF-κB誘導(dǎo)性激酶，活化IKK復(fù)合體，激活I(lǐng)KKα、IKKβ組成的信號小體，導(dǎo)致p65蛋白磷酸化，胞漿內(nèi)的NF-κB游離后進(jìn)入細(xì)胞核，啟動下游炎癥因子等基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，而這些炎癥因子又成為促進(jìn)NF-κB重新激活的刺激因素，從而導(dǎo)致級聯(lián)性彌漫性炎癥反應(yīng)［22］。本研究結(jié)果顯示，ALI組大鼠肺組織中IKKα和NF-κB p65蛋白表達(dá)較NC組明顯增多，Morin組肺組織中蛋白表達(dá)明顯受到抑制，提示NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活化可通過桑色素抑制，同時機(jī)體免疫反應(yīng)的放大程度降低，在一定程度減輕了肺損傷的發(fā)生。趙瑜等［23］通過建立幼兒ALI大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，miR-24低表達(dá)可通過抑制肺組織中p-IKK、NF-κB p65表達(dá)減輕ALI幼齡大鼠的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，桑色素可改善ALI大鼠的免疫功能和肺組織病理改變，同時抑制IKKα蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制肺組織中的炎癥反應(yīng)，減輕肺損傷。