徐本錦 范 蕾 杜 淼 宣 焱 李 璟 李卓禧 陳曉聰 吳惠文 門 杰 劉 玲楊婭男 湯文婷 寇妍祺 余駿驍 （山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，汾陽(yáng) 032200）

2019年12 月，武漢暴發(fā)了新冠病毒肺炎疫情，患者出現(xiàn)發(fā)熱、胸悶、呼吸急促等癥狀，重癥患者因急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）、多器官功能衰竭而死亡［1-2］。該病毒是20世紀(jì)以來第3種可感染人類的高致病性病原［3］。2020年2月11日，國(guó)際病毒分類委員會(huì)將其命名為“SARS-CoV-2”［4］。據(jù)WHO 報(bào)道，截至 2021年 8 月23日，全球已有211 730 035例確診病例。

SARS-CoV-2為單股正鏈RNA病毒，是目前已知的第七種冠狀病毒［5-6］。SARS-CoV-2含有2個(gè)大的開放閱讀框（ORF1a和ORF1b），二者在不同冠狀病毒中高度保守，編碼4種同源結(jié)構(gòu)蛋白：刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、核衣殼蛋白（N）及8種輔助蛋白［1，4，6-9］。

N蛋白是SARS-CoV-2的重要組成，是一種高免疫原性蛋白，在感染過程中大量表達(dá)［10-12］。N蛋白具有較高的保守性和RNA分子伴侶活性，是干擾素拮抗劑和病毒編碼的RNA干擾抑制因子［13-14］。N蛋白與病毒基因組RNA相互纏繞形成核衣殼，在病毒RNA合成過程中發(fā)揮重要作用［15］。此外，N蛋白還參與病毒mRNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，組織細(xì)胞骨架和免疫調(diào)節(jié)，調(diào)控細(xì)胞代謝和細(xì)胞周期，誘導(dǎo)感染后體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答［5-6，13，16-18］。因此，N蛋白可作為病毒檢測(cè)的標(biāo)志性蛋白，已被廣泛用于疫苗研制和血清學(xué)檢測(cè)［19-20］。但目前有關(guān)SARS-CoV-2 N蛋白的報(bào)道較少，急需對(duì)該蛋白的更新認(rèn)識(shí)。

本研究對(duì)SARS-CoV-2 N蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)生物信息學(xué)分析及原核表達(dá)，為闡明N蛋白在SARSCoV-2感染宿主細(xì)胞中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為靶向該蛋白的抗病毒藥物篩選提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 pET-22b為本實(shí)驗(yàn)室保存，蛋白和DNA marker購(gòu)自寶生物公司；E.coli感受態(tài)細(xì)胞（Top10和BL21）、質(zhì)粒提取及膠回收試劑盒購(gòu)自全式金有限公司；XhoⅠ與NdeⅠ購(gòu)自NEB；氨芐西林、IPTG、氯化鈉等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體pET-22b-N構(gòu)建 酶切N基因片段和空載體pET-22b，回收酶切后的片段，鏈接載體與N基因片段后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Top10，將驗(yàn)證后的重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。

1.2.2 N蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 37 ℃、220 r/min培養(yǎng)11.5 h，采用終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，25 ℃、160 r/min繼續(xù)培養(yǎng)8 h，10%SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)前后目的蛋白表達(dá)［21］。

1.2.3 生信分析 依據(jù)文獻(xiàn)中的網(wǎng)站對(duì)N蛋白的理化性質(zhì)等特性進(jìn)行分析[21]。

1.2.4 多序列比對(duì)與進(jìn)化分析 UniProt網(wǎng)站（https：//www.uniprot.org/blast/）下載與N蛋白序列相似度較高的12種病毒蛋白，分別用Clustal X2和MEGA7.0執(zhí)行多序列比對(duì)和進(jìn)化樹構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 理化性質(zhì) N蛋白是由419個(gè)氨基酸（共19種）組成的堿性蛋白，不含半胱氨酸。含負(fù)電荷氨基酸（Asp+Glu）36個(gè)，其中Asp 24個(gè)，Glu 12個(gè)；正電荷氨基酸（Arg+Lys+His）64個(gè)，其中Arg 29個(gè)，Lys 31個(gè)，His 4個(gè)。含量最多的為甘氨酸（10.30%），其次為丙氨酸和絲氨酸（均為8.80%，表1）。N蛋白分子量為45.62 kD，等電點(diǎn)為10.07，分子式為C1971H3137N607O629S7，消光系數(shù)為43 890 L/（mol·cm），不穩(wěn)定指數(shù)為55.09；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的半衰期為30 h，在大腸桿菌體內(nèi)＞10 h，脂肪族系數(shù)為52.53，總平均親水系數(shù)為-0.971。

表1 新冠病毒N蛋白的氨基酸組成Tab.1 Amino acid composition of SARS-CoV-2 N protein

2.2 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，SARS-CoV-2 N蛋白不存在跨膜螺旋區(qū)（圖1），不屬于跨膜蛋白。

圖1 新冠病毒N蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1 Transmembrane structure prediction of SARSCoV-2 N protein

2.3 親水/疏水性分析 親水/疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，D371親水性最強(qiáng)，Score值為-3.556；A220和L221疏水性最強(qiáng)，Score值為2.322；親水殘基數(shù)遠(yuǎn)多于疏水殘基數(shù)（圖2）。因此推測(cè)SARS-CoV-2 N蛋白為親水性蛋白。

圖2 新冠病毒N蛋白親水/疏水性分析Fig.2 Hydrophobic/hydrophobic analysis of SARS-CoV-2 N protein

2.4 功能位點(diǎn)預(yù)測(cè) SARS-CoV-2 N蛋白含有1個(gè)RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，位于N末端A50-G175位，該結(jié)構(gòu)域包含12個(gè)RNA結(jié)合位點(diǎn)，分別為A50-A55、R107、Y109、Y111、R149、A156和E174。此外，C末端P258-A359位還存在1個(gè)二聚體界面，包含51個(gè)二聚體相互作用位點(diǎn)，分別為P258、Q260-A264、V270、F274、R277、G284-F286、L291、T296、W301、I304-Q306、A308-I320、M322、V324、G328-D341、N345、F346、L353和I357。

2.5 磷酸化修飾預(yù)測(cè) 結(jié)果顯示，SARS-CoV-2 N蛋白共有可能的磷酸化修飾57個(gè)，其中蘇氨酸位點(diǎn)22個(gè)，絲氨酸位點(diǎn)31個(gè)及酪氨酸位點(diǎn)4個(gè)（圖3）。上述位點(diǎn)及對(duì)應(yīng)激酶如表2所示，通常取0.5為閾值，磷酸化勢(shì)能越高置信度越高。

表2 N蛋白磷酸化修飾及對(duì)應(yīng)激酶Tab.2 Phosphorylation sites of N protein and corresponding kinases

圖3 新冠病毒N蛋白磷酸化修飾Fig.3 Phosphorylation sites of SARS-CoV-2 N protein

2.6 糖基化修飾預(yù)測(cè)

2.6.1 N-糖基化修飾預(yù)測(cè) 結(jié)果顯示，N蛋白有2個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，分別為N47和N269（圖4）。

圖4 新冠病毒N蛋白N-糖基化修飾Fig.4 N-glycosylation site of SARS-CoV-2 N protein

2.6.2 O-糖基化修飾預(yù)測(cè) 結(jié)果顯示，N蛋白有23個(gè)潛在的O-糖基化位點(diǎn)，分別為S33、S176、S180、S183、S184、S186、S187、S188、S190、S193、S194、S197、T198、S201、S202、S206、T247、T271、T379、S410、S412、S413和T417（圖5）。

圖5 新冠病毒N蛋白O-糖基化修飾Fig.5 O-glycosylation site of SARS-CoV-2 N protein

2.7 信號(hào)肽預(yù)測(cè) 蛋白有無信號(hào)序列的判斷方法是通過預(yù)測(cè)N端前70個(gè)氨基酸中是否有潛在的酶切位點(diǎn)，結(jié)果顯示，N蛋白不含信號(hào)序列（圖6）。

圖6 新冠病毒N蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of SARS-CoV-2 N protein signal peptide

2.8 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 結(jié)果顯示，N蛋白含有α-螺旋96個(gè)（22.20%），延伸鏈66個(gè)（16.47%），β-轉(zhuǎn)角34個(gè)（6.92%），無規(guī)則卷曲223個(gè)（54.42%）。見附圖1（www.immune99.com）。

2.9 三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 通過SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫(kù)將目的蛋白與已有蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，選擇相似度高或同源蛋白進(jìn)行自動(dòng)比對(duì)建模，預(yù)測(cè)未知蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，SARS-CoV-2 N蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖7。

圖7 新冠病毒N蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及同源蛋白相似性波形圖Fig.7 Tertiary structure prediction of SARS-CoV-2 N protein and similarity waveform of its homologous proteins

2.10 抗原表位預(yù)測(cè)

2.10.1 T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè) IEDB預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，N蛋白共有15個(gè)T細(xì)胞抗原表位，分別為G5-S21、F66-N77、D81-D98、K100-L113、G116-G120、K127-D128、I130-N140、A220-L230、K257-T271、Y298、H300-W301、A305-A336、D340、H356和 K361-K369（圖8）。

圖8 新冠病毒N蛋白T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)Fig.8 Prediction of T cell epitopes of SARS-CoV-2 N protein

2.10.2 B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè) IEDB預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，取閾值為0.5，N蛋白共有11個(gè)線性B細(xì)胞抗原表位，分別為N4-I15、F17-N48、H59-S105、A119-K127、G137-Q163、T165-D216、R226-A267、R276-K299、D343-D348、D358-D402和S404-S416。根據(jù)表位分布圖最終確定N蛋白的優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)段為I15～D216（圖9）。

圖9 新冠病毒N蛋白B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)Fig.9 Prediction of B cell epitopes of SARS-CoV-2 N protein

2.11 相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 N蛋白與6種蛋白存在二元相互作用，分別為70 kD熱休克蛋白1A、抗病毒天然免疫應(yīng)答受體RIG-Ⅰ、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1-α/β、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子2、蛋白酶體激活物復(fù)合體亞單位3和富含絲氨酸和精氨酸的蛋白特異性激酶1（圖10）。

圖10 新冠病毒N蛋白的二元相互作用分析Fig.10 Binary interaction analysis of SARS-CoV-2 N protein

2.12 同源性分析 UniProt網(wǎng)站下載與SARSCoV-2 N蛋白序列相似度較高12個(gè)N蛋白序列，分別為SARS冠狀病毒、SARS冠狀病毒PUMC03、SARS 冠 狀 病 毒 PUMC02、BtRs-β-冠 狀 病 毒/HuB2013、蝙蝠非典型冠狀病毒W(wǎng)IV1、蝙蝠冠狀病毒Rp/Shaanxi2011、蝙蝠冠狀病毒Rp3/2004、蝙蝠非典型冠狀病毒YNLF_31C、SARS冠狀病毒W(wǎng)H20、蝙蝠冠狀病毒Cp/Yunnan2011、蝙蝠冠狀病毒HKU3和蝙蝠冠狀病毒279/2005。多序列比對(duì)結(jié)果顯示，與SARS-CoV-2 N蛋白序列相似度最高的為BtRs-β-冠狀病毒/HuB2013和蝙蝠冠狀病毒Rp/Shaanxi2011（均為90.3%），其次為SARS冠狀病毒、SARS冠狀病毒PUMC02和SARS冠狀病毒PUMC03（均為89.8%）。相似度最低的是蝙蝠冠狀病毒HKU3（88.8%）。此外，13條序列中完全相同（*表示）的殘基有284個(gè)（67.8%）；性質(zhì)及其相似（：表示）和性質(zhì)微弱相近（.表示）的殘基均為19個(gè)（4.5%），見附圖2（www.immune99.com）。

2.13 進(jìn)化分析 采用MEGA7.0軟件對(duì)包括SARS-CoV-2在內(nèi)的13種病毒N蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，SARS-CoV-2與蝙蝠非典型冠狀病毒YNLF_31C親緣關(guān)系最近，二者聚為一支，置信度為24，提示其可能具有共同祖先；其次，SARS冠狀病毒與蝙蝠非典型冠狀病毒W(wǎng)IV1聚為一支，置信度為20；蝙蝠冠狀病毒Cp/Yunnan2011與蝙蝠冠狀病毒HKU3聚為一支，置信度為49；BtRsβ-冠狀病毒/HuB2013與蝙蝠冠狀病毒Rp/Shaanxi 2011聚為一支，置信度為25；蝙蝠冠狀病毒Rp3/2004與蝙蝠冠狀病毒279/2005聚為一支，置信度為36（圖11）。

圖11 新冠病毒N蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.11 Phylogenetic tree of SARS-CoV-2 N protein

2.14 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

2.14.1 空載體的酶切驗(yàn)證 pET-22b空載體圖譜如圖12A，大小約5 500 bp。經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ單酶切及雙酶切后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示大小符合預(yù)期（圖12B）。

圖12 pET-22b空載體檢測(cè)及酶切驗(yàn)證Fig.12 Detection and restriction endonuclease digestion of pET-22b empty vector

2.14.2 目的片段的酶切及PCR驗(yàn)證 對(duì)N基因片段進(jìn)行XhoⅠ與NdeⅠ雙酶切（圖13A）；PCR擴(kuò)增N蛋白編碼序列，電泳檢測(cè)顯示，條帶大小正確（圖13B）。

圖13 N蛋白基因片段的酶切及菌落PCR驗(yàn)證Fig.13 Restriction endonuclease digestion and colony PCR validation of N protein gene fragment

2.14.3 重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證及轉(zhuǎn)化 將pET-22b-N進(jìn)行雙酶切，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，大小正確（圖14A）。將pET-22b-N轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，在LB平板（Amp+）上于37 ℃培養(yǎng)12～13 h（圖14B左）；將驗(yàn)證后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21，37 ℃培養(yǎng)13 h（圖14B右）。

圖14 重組質(zhì)粒pET-22b-N的酶切驗(yàn)證與轉(zhuǎn)化Fig.14 Verification and transformation of recombinant plasmid pET-22b-N

2.15 蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 挑取2個(gè)單菌落，IPTG誘導(dǎo)后10%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示：誘導(dǎo)后N蛋白表達(dá)含量比誘導(dǎo)前顯著增多（泳道4高于泳道1，泳道10高于泳道7）。為進(jìn)一步優(yōu)化N蛋白提純條件，分別對(duì)誘導(dǎo)前/后的全菌、上清、沉淀中N蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖15（黑色虛線框）：誘導(dǎo)后的N蛋白大量表達(dá)于沉淀中（泳道6、12），因此在提純?cè)摰鞍讜r(shí)考慮從沉淀進(jìn)行。

圖15 N蛋白誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè)Fig.15 Detection of induced expression of N protein

3 討論

N蛋白是病毒檢測(cè)的重要靶點(diǎn)和藥物作用靶標(biāo)，保守性高，是SARS-CoV-2的重要抗原，參與病毒基因組包裝和病毒顆粒釋放［22-23］。血清學(xué)診斷發(fā)現(xiàn)，SARS患者血清中針對(duì)N蛋白的特異性抗體比SARS-CoV其他結(jié)構(gòu)蛋白抗體具有更高的敏感性和持久性［24-25］。此外，N蛋白抗體在感染早期具有較高特異性［26］。因此，建立大量表達(dá)N蛋白的方法并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)生物信息學(xué)分析有助于深入了解該蛋白的功能和病毒RNA復(fù)制機(jī)制。

本研究顯示，SARS-CoV-2 N蛋白呈堿性，富含正電荷，有助于其與病毒基因組RNA結(jié)合［27-28］。N蛋白親水性較強(qiáng)，無信號(hào)肽，不屬于分泌型蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，N蛋白以無規(guī)則卷曲為主（54.42%），與鐘琦等［29］報(bào)道一致，為抗病毒藥物研發(fā)與新冠肺炎患者診斷提供了參考。

抗原表位分析發(fā)現(xiàn)，N蛋白有15個(gè)T細(xì)胞表位和11個(gè)線性B細(xì)胞表位，其中I15-D216是其優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位。近期研究顯示，N蛋白存在較高頻率的R203K和G204R雙位點(diǎn)變異，該變異破壞了N蛋白整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和靈活性［30］。盡管N蛋白被認(rèn)為是SARS-CoV-2疫苗開發(fā)和診療的重要靶點(diǎn)，但其持續(xù)進(jìn)化的特點(diǎn)易產(chǎn)生傳染性更強(qiáng)的突變株，導(dǎo)致病毒與已有抗體親和力下降，給疫苗研發(fā)帶來巨大挑戰(zhàn)［3］。因此，需進(jìn)一步進(jìn)行免疫信息學(xué)分析，同時(shí)持續(xù)監(jiān)測(cè)和追蹤SARS-CoV-2 N蛋白演變。

糖基化是重要的蛋白翻譯后修飾過程，高度親水的糖基對(duì)蛋白理化性質(zhì)和生理功能具有重要影響。磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機(jī)制。本研究顯示，N蛋白有2個(gè)可能的N-糖基化修飾和23個(gè)O-糖基化修飾，有31個(gè)絲氨酸磷酸化修飾，22個(gè)蘇氨酸磷酸化修飾，以及4個(gè)酪氨酸磷酸化修飾。RAHMAN等［30］對(duì)N基因突變頻率較高的20例確診病例與感染率的關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)N蛋白磷酸化修飾位點(diǎn)S250、S255、S310、S325、S327、T141、T247、T263、T265、T271和T362存在2～3種單點(diǎn)變異類型，分別為S250F/P、S255F/A/P、S310I/C/N、S325I/R/A、S327L/P、T141I/P/A、T247I/A、T263I/A、T265I/A、T271I/A 和T362I/K。此外，S193、S194、S201、S202、T205和S206等位點(diǎn)還存在不同形式的氨基端缺失變異類型。O-糖基化修飾位點(diǎn)S180是N蛋白突變形式最多的位點(diǎn)，具有6種氨基酸變異形式。以上變異可能影響SARS-CoV-2的傳播和侵染能力，但課題組并未發(fā)現(xiàn)N蛋白突變頻率與SARS-CoV-2感染率顯著相關(guān)。

N蛋白通過其N-末端結(jié)構(gòu)域（N-NTD）與病毒RNA形成復(fù)合物，在病毒復(fù)制周期中發(fā)揮重要作用，使該結(jié)構(gòu)域成為重要的藥物靶點(diǎn)［31-33］。本研究功能位點(diǎn)分析顯示，SARS-CoV-2 N蛋白含有1個(gè)RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，位于NTD A50-G175位，包含12個(gè)RNA結(jié)合位點(diǎn)，與KANG等［5］結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)N蛋白的N47-A50殘基具有高度靈活性且向外伸展，打開了RNA結(jié)合口袋，有助于同病毒基因組RNA高級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)合。RAHMAN等［30］發(fā)現(xiàn)，N蛋白A55S、P67T、D81Y、A119V、P122L、D128Y、L139F和D144Y變異增加了NTD結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，而E62V、D103Y、A119S、A152S、A156S、L161F和P168S變異則降低了該結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。同樣，E62V、P67T、D144Y和P168S變異增加了N蛋白分子柔性，而A55S、D81Y、D103Y、A119S、A119V、P122L、D128Y、L139F、A152S、A156S和L161F變異則降低了RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域分子柔性，進(jìn)一步證明上述位點(diǎn)在功能上的重要性。本研究還顯示，CTD第P258-A359位存在1個(gè)二聚結(jié)構(gòu)域，包含51個(gè)二聚相互作用位點(diǎn)。RAHMAN等［30］研究顯示，H300Y、T325I、S327L、T334I、D340N 改變?cè)黾恿薔蛋白穩(wěn)定性，而Q289H、I292T、P344S、D348H改變則降低了分子穩(wěn)定性。Q289H、I292T變異增加了分子靈活性，而H300Y、T325I、S327L、T334I、D340N、P344S和D348H則降低了分子柔韌性。提示這些結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)在提高病毒轉(zhuǎn)錄和組裝效率方面起重要作用［34-35］。

多序列比對(duì)顯示，與SARS-CoV-2 N蛋白序列相似度最高的是BtRs-β-冠狀病毒/HuB2013和蝙蝠冠狀病毒Rp/Shaanxi2011（均為90.3%），其次是SARS冠狀病毒、SARS冠狀病毒PUMC02和SARS冠狀病毒PUMC03（均為89.8%）。此外，13條序列中完全相同的殘基占67.8%，提示N蛋白在進(jìn)化上高度保守。進(jìn)化分析顯示，SARS-CoV-2與蝙蝠非典型冠狀病毒YNLF_31C親緣關(guān)系最近，二者聚為一支，置信度為24，提示其可能有共同祖先。

N蛋白是SARS-CoV-2 IgM/IgG快速檢測(cè)試劑卡的核心原材料，目前已有多家公司在真核系統(tǒng)中完成了N蛋白表達(dá)。大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)以其安全性好、易放大培養(yǎng)、周期短等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于基因工程藥物生產(chǎn)［36］。本研究構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-22b-N，菌落PCR擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果顯示，載體構(gòu)建正確。在大腸桿菌中表達(dá)N蛋白并研究其表達(dá)特性，結(jié)果顯示，經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，N蛋白即可大量表達(dá)，且主要在沉淀中表達(dá)。從IgM/IgG快速檢測(cè)試劑卡成本考慮，大腸桿菌系統(tǒng)中N蛋白表達(dá)量高、速度快，將大大降低SARS-CoV-2篩查成本［37］。

本研究有助于全面揭示N蛋白的生物學(xué)功能，為開發(fā)和設(shè)計(jì)靶向N蛋白的快速診斷方法和抗病毒藥物提供了依據(jù)。