薛 莉 瞿 偉 （南通市中醫(yī)院，南通 226001）

隨著人們生活方式的改變和老齡化社會(huì)的加劇，2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）患病率逐年上升，成為繼心腦血管疾病及腫瘤后威脅人類健康的又一嚴(yán)重疾?。?］。糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）是T2DM的常見并發(fā)癥，臨床特征為腎小管上皮細(xì)胞肥大、腎小管基底膜增厚，進(jìn)而出現(xiàn)微量白蛋白尿、大量蛋白尿、腎小管間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）及腎小球硬化等，最終導(dǎo)致終末期腎?。?］。其中RIF是終末期腎病最典型的病變，也是多種腎病發(fā)展為終末期腎功能衰竭的共同環(huán)節(jié)，而上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是形成RIF的主要病變途徑。因此抑制EMT對(duì)預(yù)防慢性腎病具有重要價(jià)值［3］。腫瘤壞死因子受體相關(guān)分子6（tumor necrosis factor receptor associated factor 6，Traf6）是Toll樣受體家族成員，參與介導(dǎo)Toll樣受體與腫瘤壞死因子受體的信號(hào)傳導(dǎo)，Traf6可以使轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶1（transforming growth factor β activated kinase 1，TAK1）磷酸化，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥、凋亡及氧化應(yīng)激的發(fā)生［4-5］。另外Traf6還參與腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程［6-7］。維生素D（vitamin D，Vit D）是脂溶性維生素，活性形式為25-羥維生素D3［25-（OH）D3］，其主要來源于食物或由暴露在紫外光下的皮膚合成。近年來研究發(fā)現(xiàn)Vit D對(duì)胰島細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，Vit D是否影響DKD患者腎小管EMT鮮有報(bào)道。

本研究通過觀察Vit D對(duì)鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的DKD大鼠Traf6/TAK1信號(hào)通路的調(diào)控作用、炎癥反應(yīng)及腎小管EMT的影響，進(jìn)一步探究Vit D在DKD發(fā)生、發(fā)展中的作用，為Vit D臨床防治RIF提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 48只8周齡、體質(zhì)量為（250±10） g的SPF級(jí)SD雄性大鼠購(gòu)自北京生物制品研究所有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SYXK（京）2020-0031。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫23 ℃、標(biāo)準(zhǔn)濕度60%、12 h/12 h晝夜交替、正常供給飼料和飲用水、分籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。本研究實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑和儀器 STZ（美國(guó)Sigma公司）；骨化三醇膠丸（上海羅氏制藥有限公司）；E-cadherin抗體（美國(guó)Protein-tech公司）；α-SMA抗體（美國(guó)Selleck公司）；Traf6、p-TAK1抗體（美國(guó)CST公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（北京博爾西科技有限公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；TGF-β1抗體、ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；Thermo酶標(biāo)儀（上海熱電儀器有限公司）；組織包埋機(jī)（德國(guó)Leica公司）；臺(tái)式冰凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；蛋白電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；便攜式血糖監(jiān)測(cè)儀（德國(guó)ACCU-Chek公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模、分組和留樣 將48只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（Control組）、模型組（Vehicle組）、治療組（Vit D組）。模型制作：Control組喂普通飼料，Vehicle組及Vit D組喂高脂高糖飼料（飼料配方：10%煉豬油，20%蔗糖，2%膽固醇，8%蛋黃粉，60%普通飼料），6周后Vehicle組及Vit D組大鼠空腹12 h后腹腔注射小劑量STZ（30 mg/kg）。注射3 d后，隨機(jī)檢測(cè)血糖，連續(xù)3次非同日尾靜脈注射≥16.7 mmol/L STZ為T2DM大鼠。T2DM成模大鼠在STZ注射后6周和7周時(shí)檢測(cè)晨尿中微量蛋白含量，若連續(xù)3次以上為陽(yáng)性，則為DKD大鼠。DKD大鼠建模成功后，Vit D組給予0.03 μg/（kg·d）骨化三醇（溶于0.05 ml花生油）灌胃8周，Vehicle組給予等量花生油灌胃，Control組不做任何處理。8周后收集大鼠24 h尿液，測(cè)定24 h尿蛋白含量及尿量。腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉（3 ml/kg）麻醉大鼠，心臟穿刺取血，分離血清，保存于-20 ℃?zhèn)溆茫瑴y(cè)定FBG、血肌酸酐、血尿素氮含量。處死大鼠后，分離兩側(cè)腎，取皮質(zhì)部分，切成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，部分用4%多聚甲醛固定，部分浸入RNA later液中，置于-80 ℃保存待測(cè)。

1.2.2 生化指標(biāo)檢測(cè) 采用德國(guó)ACCU-Chek血糖儀測(cè)定FBG，Olympus全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)尿蛋白、血肌酸酐、血尿素氮。采用ELISA法檢測(cè)血清中IL-6、IL-1β及TNF-α含量。

1.2.3 HE染色觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)改變 取出用4%多聚甲醛固定的腎臟組織，進(jìn)行脫水透明、石蠟包埋、脫蠟等操作，蘇木素染色5～6 min，伊紅染液染30 s，之后乙醇梯度脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡（×400）下觀察大鼠腎臟組織病理學(xué)改變。

1.2.4 Masson染色觀察腎臟組織纖維化改變 切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟，蘇木素染色10 min，麗春紅酸性復(fù)紅液染色5 min，磷鉬酸溶液分化5～10 s，亮綠染色6～8 min，乙醇梯度脫水，中性樹膠封片，顯微鏡（×400）下觀察大鼠腎臟組織纖維化程度。

1.2.5 免疫組化觀察腎臟 E-cadherin、TGF-β1、α-SMA表達(dá) 石蠟切片經(jīng)60 ℃熔蠟、二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水后，進(jìn)行高壓抗原修復(fù)，分別滴加一抗E-cadherin、TGF-β1、α-SMA（1∶200）孵育過夜，二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記）孵育20 min，DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇梯度脫水、透明、封片，顯微鏡（×200）下鏡檢。陽(yáng)性染色為棕黃色，隨機(jī)選取5個(gè)視野，利用Image J軟件進(jìn)行陽(yáng)性面積統(tǒng)計(jì)。

1.2.6 Western blot法檢測(cè)Traf6、p-TAK1蛋白的表達(dá) 取凍存的腎臟組織，加入RIPA裂解液，超聲勻漿提取總蛋白，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白沸水浴變性，取等量變性后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含5%脫脂牛奶死亡 TBST封閉 2 h，加入一抗 Traf6、p-TAK1（1∶2 000）4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，加入二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，用ECL化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行顯影，以GAPDH作為內(nèi)參校正，Image J軟件進(jìn)行發(fā)光結(jié)果的灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS16.0軟件，作圖工具采用Graphpad5.0，計(jì)數(shù)資料采用n（%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況及血糖、腎臟指標(biāo)比較Control組大鼠毛色順滑有光澤，飲食、飲水、尿量正常，體質(zhì)量穩(wěn)定增長(zhǎng)，活動(dòng)正常。給予高脂高糖喂養(yǎng)，腹腔注射STZ后，Vehicle組大鼠毛發(fā)暗淡無光澤，逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿情況，逐漸消瘦，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)減少。給予骨化三醇灌胃后，Vit D組大鼠情況有所改善，毛發(fā)逐漸潤(rùn)澤，飲食、飲水、尿量正常，精神逐漸恢復(fù)，體質(zhì)量穩(wěn)定增長(zhǎng)。

與Control組相比，Vehicle組大鼠FBG、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與Vehicle組相比，Vit D組大鼠FBG、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 各組大鼠FBG、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白、尿量的比較（±s）Tab.1 Comparison of FBG， creatinine， urea nitrogen， 24 h urine protein and urine volume of rats in each group （±s）

表1 各組大鼠FBG、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白、尿量的比較（±s）Tab.1 Comparison of FBG， creatinine， urea nitrogen， 24 h urine protein and urine volume of rats in each group （±s）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.01； compared with vehicle group， 2）P＜0.05.

Groups Control Vehicle Vit D FBG/（mmol·L-1）5.7±0.35 17.6±2.131）12.4±1.852）Creatinine/（μmol·L-1）97.85±7.32 146.36±8.441）121.75±6.242）Urea nitrogen/（mmol·L-1）5.23±0.45 9.16±0.761）7.56±0.682）24 h urine protein/mg 12.54±4.65 46.23±8.411）28.14±6.522）24 h urine volume/mg 23.56±6.32 126.85±9.341）76.24±8.462）

2.2 各組大鼠炎癥因子IL-6、IL-1β及TNF-α含量比較 ELISA結(jié)果顯示（圖1），與Control組相比，Vehicle組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與Vehicle組相比，Vit D組大鼠TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 各組大鼠炎癥因子IL-6、IL-1β及TNF-α含量Fig.1 Levels of inflammatory factors IL-6， IL-1β and TNF-α in each group of rats

2.3 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)改變比較 HE染色結(jié)果顯示（圖2），Control組大鼠腎小球、腎小管形態(tài)規(guī)則，囊壁結(jié)構(gòu)完整；Vehicle組腎小球形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)黏連、硬化，部分腎小管擴(kuò)張，發(fā)生壞死，無囊壁結(jié)構(gòu)，有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；Vit D組大鼠腎小球形態(tài)較規(guī)則，細(xì)胞數(shù)增多，腎小管水腫，有輕度擴(kuò)張和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，囊壁結(jié)構(gòu)完整。

圖2 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)改變（×400）Fig.2 Morphological changes of rat kidney tissue in each group （×400）

2.4 各組大鼠腎臟組織纖維化改變比較 Masson染色結(jié)果顯示（圖3），Control組大鼠腎臟為大量紅染的正常腎臟組織，Vehicle組大鼠出現(xiàn)部分藍(lán)染的膠原纖維；Vit D組大鼠呈現(xiàn)散在藍(lán)染的膠原纖維。

圖3 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)改變（×400）Fig.3 Morphological changes of rat kidney tissue in each group （×400）

2.5 各組大鼠腎臟組織E-cadherin、TGF-β1、α-SMA表達(dá)比較 免疫組化染色結(jié)果顯示（圖4），E-cadherin、TGF-β1、α-SMA蛋白陽(yáng)性表達(dá)均呈棕黃色，Control組大鼠E-cadherin蛋白在腎小管上皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，TGF-β1在腎小球和腎小管上皮細(xì)胞少量陽(yáng)性表達(dá)，α-SMA在腎小管周圍和間質(zhì)散在表達(dá)；與Control組相比，Vehicle組大鼠E-cadherin蛋白表達(dá)顯著減少，TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá)顯著增加；與Vehicle組相比，Vit D組E-cadherin蛋白表達(dá)顯著增加，TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá)顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠腎臟組織E-cadherin、TGF-β1、α-SMA表達(dá)Fig.4 Expression of E-cadherin， TGF-β1 and α-SMA in kidney tissues of rats in each group

2.6 各組大鼠腎臟組織Traf6、p-TAK1蛋白表達(dá)比較 Western blot結(jié)果顯示（圖5），與Control組相比，Vehicle組大鼠血清Traf6、p-TAK1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與Vehicle組相比，Vit D組大鼠Traf6、p-TAK1蛋白表達(dá)水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 各組大鼠腎臟組織Traf6、p-TAK1蛋白表達(dá)Fig.5 Expressions of Traf6 and p-TAK1 protein in kidney tissues of rats in each group

3 討論

DKD是由糖尿病引起的微血管病變進(jìn)而導(dǎo)致的腎小球硬化癥，是慢性腎病和腎衰竭的常見病因。其中RIF是進(jìn)展為終末期腎病的必經(jīng)途徑，而EMT是促進(jìn)RIF的重要途徑。因此探索緩解腎小管EMT及纖維化的藥物，對(duì)于改善腎臟疾病具有重要意義。近年來Vit D對(duì)DKD的保護(hù)作用備受關(guān)注。研究表明Vit D能夠減少腎臟足細(xì)胞肥大，減輕蛋白尿及腎小球硬化，抑制炎癥因子的表達(dá)及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)等，能有效緩解DKD大鼠腎臟損傷［8］。張曉玲等［9］發(fā)現(xiàn)缺乏Vit D與DKD的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，補(bǔ)充Vit D有助于DKD的治療。本研究中Vehicle組大鼠與Control組相比，毛發(fā)暗淡無光澤，出現(xiàn)多飲、多食、多尿情況，逐漸消瘦，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)減少，F(xiàn)BG、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白等指標(biāo)水平顯著升高，腎小球出現(xiàn)黏連、硬化，部分腎小管擴(kuò)張、壞死，說明制作DKD大鼠模型成功。給予Vit D干預(yù)后，Vit D組大鼠情況有所改善，毛發(fā)逐漸潤(rùn)澤，飲食、飲水、尿量正常，精神逐漸恢復(fù)，體質(zhì)量穩(wěn)定增長(zhǎng)，F(xiàn)BG、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白水平明顯下降，腎小球形態(tài)較規(guī)則，腎小管有輕度擴(kuò)張。說明Vit D能有效改善DKD損傷，與以往研究結(jié)果一致。

腎臟組織長(zhǎng)期浸潤(rùn)在高血糖環(huán)境中，能夠引起炎癥細(xì)胞過量分泌，從而激活核因子、絲裂元活化蛋白激酶家族（MAPKs）等多種炎癥信號(hào)通路，誘發(fā)TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的分泌［10］。TNF-α能夠損傷腎小管內(nèi)皮細(xì)胞，造成細(xì)胞外基質(zhì)沉積，導(dǎo)致 RIF［11］。IL-1、IL-6 可促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)分泌增多和沉積［12］。Vit D能夠改善DKD炎癥狀態(tài)，通過上調(diào)IL-10等抗炎因子及抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子的表達(dá)調(diào)節(jié)炎癥的平衡［13］。趙耀等［14］發(fā)現(xiàn)高血糖能引起腎臟組織炎癥反應(yīng)，DKD大鼠較正常組TNF-α和IL-6含量顯著上升。本研究中Vehicle組大鼠TNF-α、IL-6水平明顯升高，經(jīng)過Vit D干預(yù)后，TNF-α、IL-6水平明顯降低，說明Vit D能夠減輕DKD大鼠炎癥反應(yīng)，改善腎臟病理?yè)p害。

EMT發(fā)生后會(huì)遷移至間質(zhì)區(qū)域，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)RIF的發(fā)生［15］。其中E-cadherin是腎小管上皮細(xì)胞的標(biāo)志物，能夠維持腎臟上皮結(jié)構(gòu)及功能，其表達(dá)減少是發(fā)生EMT的早期事件。TGF-β1是公認(rèn)的EMT發(fā)生誘導(dǎo)劑，能夠單獨(dú)引起并參與整個(gè)EMT過程，從而誘導(dǎo)纖維化的發(fā)生。α-SMA是間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，會(huì)隨著腎臟成纖維細(xì)胞的激活而增多。趙宇等［16］研究發(fā)現(xiàn)高鹽能通過增加TGF-β1、α-SMA的表達(dá)誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，從而促進(jìn)大鼠腎臟纖維化。韋建輝等［17］發(fā)現(xiàn)高糖通過下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，上調(diào)α-SMA的表達(dá)，成功誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT。白雪峰等［18］發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)因子-1α通過上調(diào)TGF-β1、α-SMA的表達(dá)，降低E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)牦牛腎小管EMT的發(fā)生。本研究中Vehicle組大鼠TGF-β1、α-SMA的表達(dá)升高，E-cadherin的表達(dá)降低，且大鼠腎臟組織出現(xiàn)部分藍(lán)染的膠原纖維；經(jīng)過Vit D干預(yù)后，TGF-β1、α-SMA的表達(dá)水平明顯降低，E-cadherin的表達(dá)明顯增加，且呈現(xiàn)散在藍(lán)染的膠原纖維，說明Vit D能夠降低DKD大鼠EMT發(fā)生，從而抑制RIF。

TRAF6是一種銜接蛋白，在胞外信號(hào)刺激下TRAF6被激活，進(jìn)而使下游TAK1發(fā)生磷酸化，將胞外信號(hào)傳至胞內(nèi)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)過表達(dá)TRAF6基因，會(huì)增加TAK1磷酸化水平，進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的發(fā)生［19］。沈先敏等［20］發(fā)現(xiàn)槲皮素通過抑制TRAF6/TAK1信號(hào)通路的活化，抑制TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子的表達(dá)，從而改善脂多糖誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞炎癥損傷。李霖等［21］發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素通過抑制Traf6/TAK1通路，抑制脂多糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生，以及抑制腎小管EMT。本研究中Vehicle組較Control組TRAF6、TAK1的表達(dá)增加，Vit D干預(yù)后，TRAF6、TAK1的表達(dá)較Vehicle組降低，推斷Vit D對(duì)DKD的保護(hù)作用可能是通過抑制TRAF6/TAK1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，Vit D能夠有效改善DKD損傷，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)及腎小管EMT的發(fā)生，從而抑制RIF，可能通過抑制TRAF6/TAK1信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)DKD大鼠的保護(hù)作用。