倪紅飛 李顧楠 張偉興 李紫燕 （常州市腫瘤醫(yī)院胃腸外科，常州 213000）

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，盡管當(dāng)前關(guān)于結(jié)直腸癌的早期診斷、化療、靶向藥物治療和免疫治療技術(shù)和方案取得了很大的進(jìn)展，但結(jié)直腸癌的發(fā)生仍然嚴(yán)重威脅了人類健康［1-2］。當(dāng)前的研究認(rèn)為，腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）在結(jié)直腸癌疾病進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［3］。外泌體是腫瘤微環(huán)境中廣泛存在的分泌性囊泡，可以通過傳遞信號分子、非編碼RNA等作用于鄰近的細(xì)胞和組織，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移，調(diào)控腫瘤免疫反應(yīng)［4-5］。其中微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度為17～24 nt的小非編碼RNA，外泌體來源的microRNA可以被鄰近的細(xì)胞攝取，并通過堿基互補(bǔ)配對的方式調(diào)控細(xì)胞內(nèi)mRNA的表達(dá)，進(jìn)而影響TME中多種細(xì)胞的生理活動［6-7］。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM）是TME中最富集的免疫細(xì)胞，一般認(rèn)為，TAM與M2型極化的巨噬細(xì)胞相近，可以通過分泌IL-10、精氨酸酶1（ARG1）等抗炎因子抑制TME中的炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［8-10］。已有研究表明，miR-34a在調(diào)控TAMs極化中發(fā)揮了重要作用，然而腫瘤細(xì)胞是否可以通過外泌體遞送miR-34a影響TAMs活性和功能還未見報道。本研究通過建立腫瘤細(xì)胞-巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)實驗?zāi)Ｐ?，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌細(xì)胞可以通過外泌體中的miR-34a調(diào)控巨噬細(xì)胞THP-1的M2型極化。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT8和HCT116購自美國ATCC；人巨噬細(xì)胞系THP-1購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞保藏中心；佛波酯（PMA）購自美國Sigma-Aldrich公司；重組人IL-4購自美國PeproTech公司；總外泌體分離試劑、Lipofectmine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國ThermoFisher公司；細(xì)胞總RNA提取試劑盒、實時熒光定量PCR super Mix購自北京全式金公司；陰性對照 miRNAs（miR-NC）、miR-34a抑制物（miR-34a inhibitor）和DEPC購自上海吉瑪科技公司；Transwell細(xì)胞共培養(yǎng)小室購自美國康寧公司；FITC-anti-CD163抗體購自美國BD公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素/鏈霉素、Trypsin-EDTA消化液、Hank's平衡液（HBSS）購自美國GE公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自北京天根生物。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分化 HCT8、HCT116和THP-1細(xì)胞均使用含10%FBS和青霉素/鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每2～3 d傳代1次。誘導(dǎo)THP-1來源的巨噬細(xì)胞分化時，將THP-1傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞充分貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，加入含有20 ng/ml PMA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)48 h后，得到M0型巨噬細(xì)胞；誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞M2型極化時，對M0型巨噬細(xì)胞使用含20 ng/ml PMA以及10 ng/ml IL-4的誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，棄去誘導(dǎo)培養(yǎng)基，換成無血清DMEM培養(yǎng)基。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù) 消化并離心收集THP-1細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞，并用HBSS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個/ml，取200 μl細(xì)胞懸液，加入0.2 μl FITC-anti-CD163抗體，4 ℃避光孵育30 min，隨后加入300 μl HBSS調(diào)整上樣體積至500 μl，使用流式細(xì)胞儀檢測FL-1通道熒光信號，并統(tǒng)計CD163陽性細(xì)胞的比例。

1.2.3 結(jié)直腸癌細(xì)胞系與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng) 結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT8或HCT116接種于6孔培養(yǎng)板，每孔接種4×105個細(xì)胞，并加入1.5 ml培養(yǎng)基，同時設(shè)置空白組（Mock組），僅加入1.5 ml培養(yǎng)基，不接種細(xì)胞。待細(xì)胞充分貼壁后，將Transwell小室置于6孔培養(yǎng)板上，每孔加入500 μl完全培養(yǎng)基，并接種2×105個M2型THP-1來源的巨噬細(xì)胞，共培養(yǎng)48 h后，收集巨噬細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HCT8和HCT116細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞充分貼壁后，或THP-1細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，經(jīng)PMA和IL-4誘導(dǎo)分化成為M2巨噬細(xì)胞后，分別使用Lipofectmine 2000轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-34a inhibitor，每孔加入2 μl轉(zhuǎn)染試劑和50 pmol miRNA，轉(zhuǎn)染6 h后換成新鮮DMEM完全培養(yǎng)液。

1.2.5 實時熒光定量PCR 收集THP-1巨噬細(xì)胞，加入Trizol裂解液，室溫靜置15 min后加入氯仿，混勻后12 000 r/min離心10 min，隨后吸取上層水相，加入等體積異丙醇，混勻后12 000 r/min離心10 min，然后75%乙醇漂洗2次，充分晾干后加入DEPC水溶解，并使用分光光度法測量總RNA濃度。取1 μg總RNA，加入oligo dT引物、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。采用表1中的引物通過實時熒光定量PCR實驗檢測ARG1、IL-10和NLRP3 mRNA的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參計算各基因mRNA相對表達(dá)水平。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.6 外泌體分離 HCT8和HCT116轉(zhuǎn)染mi-RNC和miR-34a inhibitor并換液后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集培養(yǎng)基，置于4 ℃低溫離心機(jī)中，1 000 r/min離心10 min，取出懸浮的細(xì)胞及碎片。隨后，上清繼續(xù)使用12 000 r/min離心20 min，去除凋亡細(xì)胞及碎片。最后，使用超高速離心機(jī)，28 000 r/min（100 000 g）離心60 min，棄去上清，加入磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸沉淀外泌體。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間樣本比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 THP-1巨噬細(xì)胞M2型極化 通過流式細(xì)胞染色分析CD163陽性細(xì)胞比例，與未分化THP-1細(xì)胞（3.17±0.33）%和M0型巨噬細(xì)胞（9.58±2.24）%相比，IL-4誘導(dǎo)的M2型極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞CD163陽性 比例（92.46±2.64）% 顯 著升 高（P＜0.001，P＜0.001，圖1）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)分析CD163陽性細(xì)胞Fig.1 Flow cytometry analysis of CD163+ cells

2.2 結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-34a的表達(dá) 與miR-NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor的HCT8細(xì)胞（0.25±0.07，P=0.000 1）和 HCT116細(xì)胞（0.45±0.09，P=0.003 1）中miR-34a表達(dá)水平均顯著降低（圖2）。

圖2 實時熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)Fig.2 Expressions of miR-34a were measured by realtime qPCR in each group

2.3 結(jié)直腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)M2相關(guān)炎癥因子及NLRP3的表達(dá) 與空白組（Mock）相比，與結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT8共培養(yǎng)的THP-1巨噬細(xì)胞M2型極化標(biāo)志基因ARG1（2.04±0.11，P=0.000 2）和IL-10（2.17±0.14，P=0.000 2） mRNA相對表達(dá)水平顯著升高，而炎癥小體蛋白NLRP3（0.81±0.02，P=0.016 3）mRNA相對表達(dá)水平顯著降低。與結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116共培養(yǎng)的THP-1巨噬細(xì)胞ARG1（2.35±0.37，P=0.003 5）、IL-10（2.59±0.27，P=0.000 6）相對表達(dá)水平升高，而NLRP3（0.77±0.04，P=0.011 2）mRNA表達(dá)水平顯著降低（圖3）。

圖3 結(jié)直腸細(xì)胞共培養(yǎng)對THP-1細(xì)胞ARG1、IL-10和NLRP3 mRNA表達(dá)水平的影響Fig.3 mRNA expressions of ARG1，IL-10 and NLRP3 in THP-1 cell cocultured with colorectal cancer cells

2.4 敲低結(jié)直腸癌細(xì)胞miR-34a對THP-1細(xì)胞M2型極化的影響 與miR-NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor的HCT8細(xì)胞和HCT116共培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞 ARG-1（0.67±0.11，P=0.010 3；0.79±0.08，P=0.002 2）、IL-10（0.82±0.06，P=0.009 7；0.77±0.04，P=0.002 0） mRNA 顯著降低，而 NLRP3（1.58±0.23，P=0.013 9；1.42±0.11，P=0.016 3） mRNA相對表達(dá)水平顯著升高（圖4）。

圖4 敲低miR-34a對共培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞ARG1、IL-10和NLRP3 mRNA表達(dá)水平的影響Fig.4 Knockdown miR-34a affects mRNA expressions of ARG1，IL-10 and NLRP3 in cultured THP-1 cell

2.5 敲低miR-34a的結(jié)直腸癌細(xì)胞外泌體對THP-1細(xì)胞M2型極化的影響 與miR-NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor的HCT8細(xì)胞和HCT116的細(xì)胞外泌 體 處 理 的 THP-1 細(xì) 胞 ARG1（0.75±0.04，P=0.001 6；0.88±0.05，P=0.001 5）、IL-10（0.81±0.04，P=0.002 8；0.72±0.05，P=0.015 0） mRNA相對表達(dá)水平顯著下降，而 NLRP3（1.32±0.13，P=0.015 2；1.39±0.10，P=0.010 0） mRNA相對表達(dá)水平顯著升高（圖5）。

圖5 miR-34a缺失的外泌體對共培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞ARG1、IL-10和NLRP3 mRNA表達(dá)水平的影響Fig.5 Effects of miR-34a-deficient exosomes on expression levels of ARG1， IL-10 and NLRP3 mRNA in cocultured THP-1 cells

2.6 敲低miR-34a對THP-1細(xì)胞M2型極化的影響 如圖6所示，與miR-NC組相比，直接轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor的 M2 型巨噬細(xì)胞中 miR-34a（0.73±0.05，P=0.034 7）、ARG1（0.42±0.13，P=0.002 4）、IL-10（0.76±0.05，P=0.084 0）mRNA相對表達(dá)水平顯著下降，而NLRP3（3.06±0.47，P=0.001 7）mRNA相對表達(dá)水平顯著升高。

圖6 實時熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞中miR-34a、ARG1、IL-10和NLRP3 mRNA表達(dá)Fig.6 mRNA expressions of miR-34a， ARG1， IL-10 and NLRP3 were measured by real-time qPCR

3 討論

通過外泌體調(diào)控腫瘤微環(huán)境，干預(yù)腫瘤的生長是當(dāng)前結(jié)直腸癌研究中的熱點問題。一方面，TME中多種細(xì)胞來源的外泌體可以直接影響腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，另一方面，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體也可以調(diào)控TME中的免疫細(xì)胞活性［11］。巨噬細(xì)胞是組織中最常見的免疫細(xì)胞之一，在激活后可以通過吞噬作用清除病原體和受損的細(xì)胞，也可以通過分泌多種細(xì)胞因子調(diào)控免疫反應(yīng)。巨噬細(xì)胞常見的有兩種極化形態(tài)，M1型和M2型。其中M1型巨噬細(xì)胞通常分泌IL-1β、TGF-β等促炎因子，而M2型巨噬細(xì)胞則主要產(chǎn)生IL-10等因子拮抗炎癥反應(yīng)，TAMs則更接近M2型活化的巨噬細(xì)胞［12］。

本研究利用體外培養(yǎng)的人巨噬細(xì)胞系THP-1，經(jīng)過PMA和IL-4的聯(lián)合誘導(dǎo)成為M2型巨噬細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)，THP-1來源的M2型巨噬細(xì)胞經(jīng)過與結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT8和HCT116共培養(yǎng)，可以促進(jìn)其M2型的極化。進(jìn)一步實驗驗證發(fā)現(xiàn)若通過轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor敲低結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)，則其促進(jìn)THP-1細(xì)胞M2型極化的作用被減弱。進(jìn)一步通過分離HCT8和HCT116細(xì)胞來源的外泌體，發(fā)現(xiàn)敲低miR-34a的細(xì)胞來源的外泌體對THP-1細(xì)胞M2型極化的促進(jìn)作用也被減弱。這些結(jié)果提示結(jié)直腸癌細(xì)胞來源的外泌體可能通過miR-34a來影響巨噬細(xì)胞的M2型極化。miR-34a已知在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)異常表達(dá)，而其表達(dá)水平與腫瘤的增殖、浸潤等密切相關(guān)［13］。本研究還發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞共培養(yǎng)影響THP-1細(xì)胞M2型極化的同時，巨噬細(xì)胞中NLRP3的表達(dá)水平也顯著下降。NLRP3炎癥小體是人體固有免疫系統(tǒng)中重要的調(diào)控因子，主要由NLRP3受體、接頭蛋白ASC和caspase-1蛋白酶組成分子量約700 kD的復(fù)合物，促進(jìn)多種炎癥因子的分泌，調(diào)控炎癥反應(yīng)［14-15］。有研究表明，許多調(diào)控因子可以通過對NLRP3表達(dá)和激活的調(diào)節(jié)，影響巨噬細(xì)胞M1型或M2型極化［16］。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌外泌體可以直接抑制THP-1巨噬細(xì)胞NLRP3的表達(dá)，同樣，在THP-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-34a mimic也抑制了巨噬細(xì)胞NLRP3的表達(dá)及ARG1和IL-10的表達(dá)。GAO等［17］研究發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞外泌體來源的miR-34a可以靶向大鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中的NLRP3，影響巨噬細(xì)胞的M1型極化。這些結(jié)果提示結(jié)直腸癌細(xì)胞外泌體來源的miR-34a可能直接負(fù)向調(diào)控于THP-1細(xì)胞中的NLRP3表達(dá)，進(jìn)而影響其M2型極化。

腫瘤細(xì)胞內(nèi)miR-34a的功能已有較多的研究成果，但腫瘤外泌體來源的miR-34a的功能卻一直缺少相關(guān)研究。本文發(fā)現(xiàn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞外泌體來源的miR-34a對巨噬細(xì)胞M2型極化的影響，為腫瘤外泌體的功能研究提供了新的視角。