王海川 陽 倩 唐彬秩 李茂軍 石 偉 吳 青

（四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院兒科，成都 610072）

膿毒癥是新生兒常見危急重癥，病死率高，預(yù)后差，膿毒癥相關(guān)性腦病是常見并發(fā)癥，對小兒腦損傷嚴(yán)重，影響其遠(yuǎn)期生活質(zhì)量，臨床癥狀主要以譫妄、意識水平改變?yōu)橹饕卣?，輕者表現(xiàn)為煩躁不安、注意力缺陷，嚴(yán)重者可導(dǎo)致遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙，智力低下、學(xué)習(xí)能力減弱、執(zhí)行功能障礙，部分患兒甚至可遺留癇性發(fā)作，導(dǎo)致患兒死亡風(fēng)險上升［1-3］。

目前有關(guān)新生兒膿毒癥相關(guān)性腦病導(dǎo)致遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙的研究較少，發(fā)病機(jī)制尚不明確，主要集中在信號傳導(dǎo)學(xué)說、炎癥反應(yīng)學(xué)說、谷氨酸導(dǎo)致的興奮性毒性學(xué)說等［4］?，F(xiàn)研究主要聚焦于腦線粒體氧化呼吸鏈功能障礙后，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，大腦病理切片及影像學(xué)表現(xiàn)為囊性改變及局灶性液化壞死，中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)不可逆損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致患者發(fā)生遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙［5］。但在臨床工作中也發(fā)現(xiàn)，有部分患兒雖經(jīng)過治療后觀察到神經(jīng)系統(tǒng)影像學(xué)無明顯的囊性改變或局灶壞死，但仍出現(xiàn)抑郁、焦慮及社交障礙，甚至在該類患兒中有14%嚴(yán)重病例需要進(jìn)入特殊學(xué)校學(xué)習(xí)及心身醫(yī)學(xué)科的治療［6-7］。目前的研究未能全面解釋該病的發(fā)病原因，因此對其機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

Tau蛋白是腦內(nèi)含量最為豐富的微管相關(guān)蛋白，在學(xué)習(xí)記憶過程中發(fā)揮了重要作用，如參與神經(jīng)元的營養(yǎng)及軸突的運(yùn)輸、維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)部的正常生物學(xué)信號傳導(dǎo)［8］。在疾病狀態(tài)下，Tau蛋白出現(xiàn)過度磷酸化，導(dǎo)致神經(jīng)元出現(xiàn)神經(jīng)纖維纏結(jié)，損傷神經(jīng)元，并進(jìn)一步誘發(fā)患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙［9］。截至目前，國內(nèi)外在新生兒膿毒癥介導(dǎo)的相關(guān)性腦病的研究中，關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的Tau蛋白是否出現(xiàn)異常磷酸化的研究較少，且Tau蛋白在其中的作用也尚不清楚。因此，本研究通過構(gòu)建新生小鼠膿毒癥模型，探討新生兒膿毒癥導(dǎo)致患者遠(yuǎn)期認(rèn)知功能出現(xiàn)障礙，是否與Tau蛋白過度磷酸化存在關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 C57BL/6J孕鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量30 g左右。動物飼養(yǎng)在四川省人民醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心，溫度20 ～25 ℃，相對濕度55%～65%，整個實(shí)驗(yàn)過程和實(shí)驗(yàn)操作符合國際實(shí)驗(yàn)動物認(rèn)可和評估委員會認(rèn)證的要求。

1.1.2 藥品與試劑 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，L2880）、anti-pS396 抗體（ab109390，1∶5 000，Sigma公司）；戊巴比妥鈉（T8590，索萊寶公司）；PVDF膜（IPVH00010，Millipore公司）；脫脂奶粉（232100，BD公司）；anti-IL-1β抗體（ab9787，1∶1 000）、anti-TNF-α抗體（ab66579，1∶1 000）、anti-pS404抗體（2691-1，1∶5 000，Abcam公司）；anti-Tau抗體（MA-12808，1∶1 000，ThermoScientific公司）；anti-GAPDH抗體（ZSGB-BIO，1：2 000，中杉金橋公司）；anti-MouseIgG-HRP 抗體（M210015，1∶1 000）、anti-RabbitIgG-HRP抗體（M210025，1∶1 000，Abmart公司）；Donkey anti-Mouse（AlxaFluor594）抗 體（A-21203，1∶400，Invitrogen公司）；TNF-α ELISA試劑盒（MB-2868B）、IL-1β ELISA試劑盒（MB-2776B，江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司）。

1.1.3 主要儀器 BIO-RAD MiniPROTEAN Tetra電泳儀、BIO-RAD Trans-Blot半干轉(zhuǎn)膜儀（BIO-RAD，美國）；低溫離心機(jī)（Heal Force Neofuge 13R，中國）；全波長酶標(biāo)儀（MD Spectra Max 190，美國）；BIORAD Chemical XRS+顯影系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 選取出生后第5天C57BL/6J小鼠腹腔注射LPS（100 μg/kg），誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)，構(gòu)造膿毒癥小鼠模型。選取經(jīng)LPS干預(yù)下且存活至8周的小鼠12只設(shè)為模型組，正常小鼠12只設(shè)為對照組。

1.2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評估 采用曠場實(shí)驗(yàn)、新奇實(shí)驗(yàn)、新物體位置識別實(shí)驗(yàn)分別評估C57BL/6J小鼠記憶和焦慮行為。曠場實(shí)驗(yàn)：將小鼠放置在正方形的場地（長48 cm×寬48 cm ×高30 cm）中央，通過頂部的攝像機(jī)觀察實(shí)驗(yàn)小鼠在5 min內(nèi)的活動總距離和在角落區(qū)域內(nèi)的時間，結(jié)果通過EthoVision8.5軟件來進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。新奇實(shí)驗(yàn)：在一正方形的箱內(nèi)（長48 cm×寬48 cm×高30 cm）讓小鼠自由活動10 min，以熟悉周圍環(huán)境。然后將實(shí)驗(yàn)小鼠放回原居住鼠籠。把A、B兩個相同物體放入箱內(nèi)，并且固定好位置，再次放入實(shí)驗(yàn)小鼠，讓其自由探索10 min，探索完成后再將小鼠放回鼠籠。第2天將試驗(yàn)用物A替換為物C，物B位保持原位置，再將實(shí)驗(yàn)小鼠放入箱中，讓其活動10 min，記錄小鼠在B、C兩個物體周圍活動的時間。新物體位置識別實(shí)驗(yàn)是在原實(shí)驗(yàn)環(huán)境及原實(shí)驗(yàn)步驟的基礎(chǔ)上，將物A由原來位置換到新標(biāo)記位置，物B保持原位置，記錄小鼠在A、B兩物體的活動時間，結(jié)果均通過EthoVision 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

1.2.3 Western blot蛋白水平測定 各組小鼠海馬組織，通過蛋白裂解試劑盒提取蛋白原液，采用Bandford法檢測蛋白濃度，每組取蛋白樣品20 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，跑膠完成后，將膠移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜完成后將膜放置5%脫脂牛奶封閉1 h，再添加Ⅰ抗4 ℃過夜。第2天給予含有辣根過氧化物酶的Ⅱ抗室溫下孵育2 h。BIO-RAD Chemical XRS+顯影系統(tǒng)對條帶顯影，采用Imege J 3.0軟件系統(tǒng)分別測定各組小鼠蛋白的灰度值。

1.2.4 ELISA檢測外周血清中IL-1β、TNF-α 稱量模型組及對照組小鼠體質(zhì)量；取1%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）腹腔注射麻醉；取模型組及對照組C57BL/6J小鼠外周血，置于室溫后1 h，4 ℃，2 000 r/min離心20 min后吸取血清備用，按照小鼠IL-1β、TNF-α試劑盒的檢測方法檢測小鼠血清中IL-1β、TNF-α的含量。

1.2.5 免疫熒光檢測海馬齒狀回腦區(qū)Tau蛋白稱量模型組及對照組小鼠體質(zhì)量，取1%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）腹腔注射麻醉。經(jīng)心臟用4%多聚甲醛灌注后取出腦組織，用冷凍包埋劑包埋組織后，利用冷凍切片機(jī)切片（40 μm），切片完成后放置-20 ℃冰箱中保存。將切片用PBS液沖洗3次，每次5 min。加入5%的驢血清進(jìn)行封閉，室溫2 h。加入Ⅰ抗Tau（1∶150），在4 ℃下孵育過夜。次日用PBS液沖洗3次，每次5 min。加入熒光Ⅱ抗，在室溫下孵育2 h，用PBS液沖洗3次，每次3 min。最后加入含有Dapi的熒光淬滅液封片。采用熒光顯微鏡對海馬組織中齒狀回腦區(qū)Tau蛋白的表達(dá)進(jìn)行觀察，Image J 3.0軟件系統(tǒng)對拍攝的圖片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以±s表示。使用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)處理。對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)測試結(jié)果 在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠與對照組小鼠相比，在測定運(yùn)動距離及角落時間方面明顯滯后于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1A、B）；測定模型組小鼠與對照組小鼠對新物體識別及物體位置探索后發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠對新物體和物體位置沒有明顯的偏好，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1C、D）。

圖1 曠場試驗(yàn)、新奇試驗(yàn)和新物體位置識別試驗(yàn)Fig.1 Open field test，novel object recognition test and new object position recognition test

2.2 外周血清IL-1β、TNF-α水平檢測 與對照組水平相比，在出生后8周時模型組小鼠外周血清IL-1β、TNF-α 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2）。

圖2 外周血清IL-1β和TNF-α的水平檢測Fig.2 Levels of IL-1β and TNF-α in peripheral serum

2.3 腦組織中IL-1β、TNF-α、Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白的表達(dá) 在出生后8周時模型組小鼠腦組織中IL-1β和TNF-α的表達(dá)高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3A）；此外，與對照組相比，模型組小鼠Tau蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，第396和第404蘇氨酸位點(diǎn)的磷酸化水平顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3B）。

圖3 腦組織內(nèi)IL-1β和TNF-α、Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of IL-1β and TNF-α，Tau protein and phosphorylated Tau protein in brain tissue

2.4 免疫熒光觀察海馬齒狀回腦區(qū)中Tau蛋白表達(dá) 在病理切片上，模型組小鼠海馬齒狀回腦區(qū)Tau蛋白的表達(dá)相較于對照組小鼠明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。

圖4 小鼠海馬齒狀回腦區(qū)Tau蛋白表達(dá)（免疫熒光染色，×100）Fig.4 Expression of Tau protein in dentate gyrus of mouse hippocampus （immunofluorescence staining，×100）

3 討論

研究表明，線粒體功能障礙、谷氨酸興奮性毒性作用、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元自噬現(xiàn)象均與新生兒膿毒癥相關(guān)性腦病的遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙存在關(guān)聯(lián)［10］。本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠在出生后8周時行為學(xué)出現(xiàn)異常，考慮可能與炎癥反應(yīng)作用于機(jī)體后導(dǎo)致大腦功能受損，行為學(xué)出現(xiàn)異常存在關(guān)聯(lián)。全身炎癥反應(yīng)早期機(jī)體炎癥因子大量釋放，內(nèi)皮細(xì)胞遭到破壞后，血腦屏障通透性增加，炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-10進(jìn)一步作用于免疫細(xì)胞， CD4+T淋巴細(xì)胞的循環(huán)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致大腦內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量增加，外周血中CD4+T細(xì)胞減少，促進(jìn)Th1淋巴細(xì)胞向Th2淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化增加，加速免疫失衡進(jìn)程［11-12］。本次實(shí)驗(yàn)測定模型組腦內(nèi)IL-1β和 TNF-α的含量明顯高于對照組，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果同國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道一致，表明膿毒癥小鼠腦內(nèi)存在炎癥反應(yīng)［13］。

國內(nèi)有學(xué)者研究報(bào)道膿毒癥后期腦組織出現(xiàn)了局部囊性改變或液化壞死病灶，主要發(fā)生在海馬、枕葉部位，海馬組織參與學(xué)習(xí)、記憶及情感調(diào)控，海馬組織病變與行為學(xué)異常密切相關(guān)［14］。目前國內(nèi)外較多的膿毒癥模型多采用出生后1個月或成熟期小鼠作為動物模型，本次實(shí)驗(yàn)與以往研究有所不同，采用出生5 d幼鼠造模，觀察了海馬區(qū)Tau蛋白的變化。生命早期免疫功能尚不成熟，機(jī)體對炎癥因子的打擊反應(yīng)程度不同，機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)也存在差異性，導(dǎo)致器官損傷部位及程度也不盡相同［15-16］。本實(shí)驗(yàn)從模型構(gòu)造的差異性及誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)的不同狀態(tài)出發(fā)，來探討其遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙的可能發(fā)病機(jī)制。

本次實(shí)驗(yàn)同時測定外周血清中IL-1β、TNF-α的濃度，對照組與模型組無明顯差異，目前研究報(bào)道疾病早期外周及顱內(nèi)炎癥因子均升高二者存在一致性，而后期二者相關(guān)性的研究目前暫無文獻(xiàn)報(bào)道，考慮與機(jī)體外周免疫調(diào)節(jié)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制可能存在不同的信號通路存在關(guān)聯(lián)［17-18］。顱內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞活化后，導(dǎo)致炎癥瀑布反應(yīng)持續(xù)存在，慢性炎癥因子浸潤，神經(jīng)元出現(xiàn)不可逆損傷［19-20］。而外周大部分組織器官代償增生能力較強(qiáng)，通過免疫自穩(wěn)促進(jìn)機(jī)體的自身修復(fù)來降低炎癥因子損傷，使顱內(nèi)炎癥因子明顯升高，而外周炎癥因子無明顯變化［21-22］。

Tau蛋白是腦內(nèi)含量最為豐富的微管相關(guān)蛋白，可分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，參與維持大腦正常發(fā)育［23］。Tau蛋白是否參與了新生兒膿毒癥相關(guān)性腦病遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制，目前國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較少。通過本次研究發(fā)現(xiàn)，顱內(nèi)炎癥因子含量明顯升高時，Tau蛋白也呈現(xiàn)出過度磷酸化狀態(tài)，考慮二者之間可能存在關(guān)聯(lián)性。炎癥狀態(tài)下，Ca2+可出現(xiàn)明顯的濃度差異，而鈣激酶活性受Ca2+濃度調(diào)節(jié)，鈣激酶可通過影響糖原合成酶激酶3 （glycogen synthase kinase 3，GSK3）來參與調(diào)節(jié)Tau蛋白磷酸化［24-25］。目前已有研究發(fā)現(xiàn)GSK3主要通過促進(jìn)Tau蛋白 Thr205、Thr212、Ser214、Thr217和 Ser396/404多個位點(diǎn)發(fā)生過度磷酸化參與認(rèn)知功能障礙［26-28］。GSK3磷酸化位點(diǎn)的不同，發(fā)揮的生物活性也存在差異，如ser9位點(diǎn)的磷酸化可抑制鈣激酶對GSK3的剪切及抑制作用［29-30］。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道Tau蛋白磷酸化位點(diǎn)多以Ser202/205位點(diǎn)為主［31］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Tau蛋白主要以Ser396/404磷酸化位點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，與既往報(bào)道磷酸化位點(diǎn)有所不同，有研究報(bào)道小鼠腦損傷后檢測3個月時顱內(nèi)Tau蛋白磷酸化水平無明顯變化，而在16個月時才出現(xiàn)明顯異常，考慮Tau蛋白磷酸化位點(diǎn)的不同及時間差異性，可能與腦損傷的年齡段、原發(fā)疾病及試驗(yàn)對象品系基因易感性相關(guān)［32-33］。

綜上所述，在本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠出現(xiàn)了遠(yuǎn)期行為學(xué)異常，外周血清中炎癥因子無明顯變化，但海馬組織中炎癥因子濃度升高，且出現(xiàn)Tau蛋白過度磷酸化，考慮到炎癥因子作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)后，導(dǎo)致免疫失衡及Tau蛋白異常，這可能是膿毒癥相關(guān)性腦病發(fā)生遠(yuǎn)期行為學(xué)異常的重要原因。因此對中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫功能的研究，將有助于更好地探討新生兒膿毒癥及其遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙可能的發(fā)病機(jī)制。