滕宗佑 萬家秀 趙培植

（1. 蘭州市生態(tài)環(huán)境局榆中分局，甘肅蘭州 730020；2. 蘭州資源環(huán)境職業(yè)技術(shù)大學(xué)，甘肅蘭州 730021）

1 引言

水傳性病原體對公眾健康具有重大威脅。在水處理中，病毒病原體尤其難以監(jiān)測和控制，且相對于細菌等病原污染，病毒對消毒措施具有更強的抗性。因此，對消毒過程中病毒的滅活機理及其抗性發(fā)展的研究，對于水處理過程中消毒措施的確定及強抗性病毒預(yù)防追蹤具有重要意義。

消毒措施對病毒的滅活作用源于基因組損傷與蛋白質(zhì)損傷，病毒消毒動力學(xué)已對此深入研究，但其分子水平的滅活機制仍有探究空間。在目前闡述的常用消毒手段的機理研究中，彼此差異較大且往往互相矛盾。不同消毒滅活手段對不同結(jié)構(gòu)的病毒具有不同的作用機制，同時，在過往的研究［1-3］中，研究者發(fā)現(xiàn)基因組、結(jié)構(gòu)相似的病毒對于同一種消毒劑也可能表現(xiàn)出截然不同的反應(yīng)［4］。消毒手段也成為病毒進化變異的重要選擇壓力［5］。病毒在消毒過程中，通過聚集、粘附、內(nèi)化等方式增強抗逆性［6］，并在自然選擇壓力下使得對消毒劑具有抗性突變基因的群體成為優(yōu)勢種群，有助于預(yù)測不可培養(yǎng)性病毒株對消毒的敏感性，并對病毒抗性發(fā)展作出追蹤預(yù)測，改進消毒方法［7］。

本文總結(jié)不同消毒手段對不同病毒的滅活作用及病毒對消毒滅活的抗性機理，介紹水傳性病毒病原體特征及常用消毒手段、消毒操作對病毒滅活的手段及機理、病毒對消毒措施的抵抗及其抗性情況，以期為水傳播病毒的消毒滅菌策略設(shè)計、病毒滅活情況預(yù)測及其抗性發(fā)展提供參考。

2 水傳性病毒病原體特征及病毒的滅活機理

2.1 水傳性病毒病原體特征

病毒是非細胞型微生物，具有遺傳、變異、增殖、侵染等生物特征，可作為病原體引起疾病。其主要化學(xué)成分是核酸（RNA 或DNA）和蛋白質(zhì)，也含有脂質(zhì)和多糖。以核酸和衣殼（蛋白質(zhì)外殼）作為基本結(jié)構(gòu)，一些病毒中，衣殼被含脂蛋白或脂質(zhì)的包膜包圍。核酸可能包含一條或兩條鏈，為病毒粒子提供傳染性，而蛋白質(zhì)外殼則保護其免受不利環(huán)境的影響。病毒不帶有任何細胞器，無法在宿主細胞以外的環(huán)境條件中復(fù)制或長時間存活［8］。水環(huán)境中致病微生物的研究頗受重視，在消毒處理如何使細菌滅活方面已取得進展［9］，但針對病毒的詳細機理及可能的病毒抗性發(fā)展研究仍不完善。因而對有關(guān)消毒處理對病毒的滅活機理進行總結(jié)很有必要。部分常見的病毒種類及其特征見表1。

表1 部分常見病毒種類及特征

2.2 消毒操作對病毒滅活的機理

目前消毒操作是滅活水體中致病性病毒的重要手段。病毒失活表現(xiàn)為傳染性關(guān)鍵功能的喪失，而這常由蛋白質(zhì)或基因組的改變引起［5］。病毒增殖過程中可分為三大環(huán)節(jié)：一是與宿主細胞結(jié)合（host binding）；二是基因組注入宿主細胞（genome infection）；三是基因組復(fù)制擴增（genome replication）。病毒蛋白負責(zé)介導(dǎo)與宿主細胞的結(jié)合和基因組注射，而完整的病毒基因組是調(diào)控宿主細胞內(nèi)形成新病毒粒子的必要條件［10］。

研究顯示，不同的消毒方式對于不同的病毒種類，其分子水平的作用機理并不相同。定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和定量蛋白質(zhì)質(zhì)譜（MALDITOF MS）是在分子水平上監(jiān)測病毒基因組與蛋白質(zhì)組的重要技術(shù)手段。

2.2.1 紫外線消毒

紫外線（UV）照射常被應(yīng)用于水處理廠消毒中。Elbashir 等［11］的研究顯示，Tulane 病毒（TV）與輪狀病毒（RV）對于不同波長的紫外線敏感度不同，TV 病毒對于波長在220～254 nm 間的紫外線敏感程度相似，紫外線照射誘變了病毒基因組使之無法在宿主細胞內(nèi)復(fù)制或用于合成蛋白質(zhì)，并造成衣殼結(jié)合蛋白突變，使TV 病毒無法與宿主細胞結(jié)合，進而終止病毒感染；RV 則對220 nm 波長的紫外線較254 nm波長的紫外線更敏感，在220 nm 及254 nm 的紫外線照射后均未喪失與宿主細胞結(jié)合的能力，但220 nm的紫外線照射誘變了RV 病毒基因組片段，使得病毒復(fù)制受阻。另有研究表明，紫外線處理MS2 噬菌體時既對其RNA 進行轉(zhuǎn)化，抑制了基因組的復(fù)制，同時損傷蛋白質(zhì)，抑制其遺傳物質(zhì)的注入能力，Rattanakul 等［12］的研究證實了紫外線對MS2 病毒的主要處理目標是其基因組，在他們的研究中，因紫外線照射在MS2 病毒基因組上誘導(dǎo)隨機生成胸腺嘧啶二聚體造成的基因組復(fù)制能力喪失對病毒感染性喪失的貢獻率為86%。在對具有包膜的假單胞菌Phi6 噬菌體病毒的處理中，紫外線也體現(xiàn)出對其基因組的誘變失活，但對其作用效果不及無包膜病毒［13］。由此可以發(fā)現(xiàn)，具有不同基因組和衣殼結(jié)構(gòu)的FV，TV，MS2 噬菌體病毒及假單胞菌Phi6 噬菌體病毒受紫外線照射失活的靶向結(jié)構(gòu)并不相同，病毒蛋白質(zhì)及其核酸均可能成為目標對象，但損傷強度不同。紫外線的主要作用對象是病毒基因組，且對無包膜病毒基因組作用效果較好。

2.2.2 游離氯消毒

游離氯對病毒功能結(jié)構(gòu)的破壞位點也體現(xiàn)出種間差異性。Ye 等［13］的研究顯示，Phi6 噬菌體對游離氯滅活的敏感性比無包膜病毒MS2 高30 倍，他們發(fā)現(xiàn)，對于具有包膜的假單胞菌Phi6 噬菌體病毒，游離氯處理后，基因組受損的病毒比例小于失活的病毒比例，脂質(zhì)膜反應(yīng)產(chǎn)物含量少且并不是常規(guī)的氧化產(chǎn)物，而蛋白質(zhì)中與氯反應(yīng)活性最高的肽的速率常數(shù)與病毒失活相近，這說明游離氯對Phi6 噬菌體的滅活是由蛋白質(zhì)反應(yīng)主導(dǎo)的而非基因組反應(yīng)和脂質(zhì)反應(yīng)，無包膜的MS2 噬菌體病毒與游離氯的反應(yīng)主要由基因組反應(yīng)和脂質(zhì)反應(yīng)驅(qū)動，同時，Phi6 噬菌體蛋白質(zhì)關(guān)鍵肽中甲硫氨酸殘基及半胱氨酸殘基的含量與蛋白質(zhì)和游離氯的反應(yīng)活性相關(guān)，進一步研究顯示，Phi6 噬菌體蛋白質(zhì)中相對較多的溶劑可及的甲硫氨酸和半胱氨酸殘基，可能是其較MS2 病毒對游離氯滅活更敏感的原因。游離氯對腺病毒（HAdV）的滅活則主要作用于HAdV 完成宿主細胞結(jié)合后、在病毒早期蛋白質(zhì)合成之前，HAdV 蛋白質(zhì)是其主要作用位點?？偟膩碚f，游離氯可靶向作用于基因組和蛋白質(zhì)，導(dǎo)致復(fù)制及與侵染有關(guān)的蛋白質(zhì)介導(dǎo)功能的喪失［14］。

2.3 消毒措施對比

即使是同一病毒，不同的消毒措施其主要作用位點也不盡相同。Wigginton 等［14］發(fā)現(xiàn)UV 照射導(dǎo)致MS2 失活主要通過轉(zhuǎn)化RNA 本身抑制基因組復(fù)制，同時通過降解外殼蛋白殘基抑制了其遺傳物質(zhì)的注入能力，單線態(tài)氧（1O）2通過破壞基因組復(fù)制而導(dǎo)致失活；二氧化氯（ClO2）較核苷酸更易與氨基酸反應(yīng)，通過選擇性破壞病毒結(jié)構(gòu)蛋白上的易感區(qū)使病毒失活，而基因組保持完整；游離氯對基因組損傷范圍大，但引起的復(fù)制功能喪失對其整體失活的貢獻低，對特異性位點的外殼蛋白的降解使得MS2 喪失基因組注入宿主細胞的能力。Decrey 的研究表明，MS2病毒的基因組是氨（NH）對其失活作用的靶點，這一作用可能是由于MS2 單鏈RNA 中的核糖易受堿性酯交換的影響，而相比DNA 病毒及雙鏈RNA 病毒對氨作用更敏感。在這些研究中，并未發(fā)現(xiàn)對所有消毒方式都敏感的“薄弱環(huán)節(jié)”，這或許可以說明，針對病毒的滅活往往可以有多種對策。

3 病毒對消毒措施的抵抗及其抗性情況

病毒可以通過形成聚集體的方式抵抗不利環(huán)境條件，自然選擇壓力下的病毒進化也為其抵抗消毒措施帶來的不良影響提供幫助。

病毒在廢水和自然環(huán)境中通常以聚集體形式存在，但在確定滅活相應(yīng)病毒所需的消毒劑劑量時通常視之為分散的病毒進行計算。Galasso 和Sharp［15］在紫外線對痘苗病毒的滅活作用研究中發(fā)現(xiàn)，有79%的病毒形成2～80 個粒子的聚集體，僅21%的病毒以孤立粒子的形式存在。且孤立的粒子比聚集體更易被破壞，聚集效應(yīng)顯著的病毒群體受紫外線影響的滅活速率比聚集現(xiàn)象不明顯的群體慢得多。另一項研究顯示，位于宿主細胞內(nèi)的脊髓灰質(zhì)炎病毒中，有80%的個體以聚集體形式存在［16］，表明聚集狀態(tài)可能是大多數(shù)病毒在水中的存在形式。

大規(guī)模的病毒聚集體的存在，可能造成對病毒數(shù)量及病毒威脅的誤判。Sharp 等［17］指出細胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的大的病毒聚集體很少被發(fā)現(xiàn)，且難以被電子顯微鏡區(qū)分，進而難以估計其真實數(shù)量。另有研究顯示［18］，聚六亞甲基雙胍陽離子消毒劑可誘導(dǎo)病毒聚集體的形成，改變消毒劑的滅活動力學(xué)，使得消毒劑的作用效果被高估。研究者在消毒劑處理后的樣品中發(fā)現(xiàn)了直徑高達500 nm 的MS2 噬菌體聚集體，這樣的聚集顯著減少了病毒斑塊單位的形成數(shù)量，表明病毒聚集體的形成可降低消毒措施的有效性，并干擾消毒效果的評估。病毒具有的較高的群體數(shù)量和變異率，增加了群體內(nèi)的遺傳多樣性，使其能夠快速進化并適應(yīng)環(huán)境壓力。而以水及廢水處理系統(tǒng)為代表的基礎(chǔ)設(shè)施，也通過不斷的消毒處理成為病毒進化的驅(qū)動力［19］。MS2 噬菌體病毒在反復(fù)接觸ClO2的情況下，各突變株對ClO2的敏感性不同；接觸ClO2的病毒種群相比于未暴露于ClO2環(huán)境下的種群，對ClO2的易感性更低。在經(jīng)游離氯處理后的水體中分離得到的柯薩奇B4 病毒，相比于實驗室菌株對游離氯更具抗性，表明病毒對消毒手段的抗性具有遺傳基礎(chǔ)，且可能受到進化機制的影響［20］。

Zhong［21］等對MS2 噬菌體對ClO2產(chǎn)生的抗性實驗表明，MS2 噬菌體對ClO2滅活的抗性具有特異性。但同樣的抗性也出現(xiàn)在未暴露于ClO2環(huán)境的群體中，說明兩種樣品共同面對的有效且反復(fù)擴大種群數(shù)量的壓力，在促進抗性產(chǎn)生的過程中起到主導(dǎo)作用，這有利于提高增殖能力的突變，也有利于在ClO2消毒環(huán)境下的存活。表明對消毒措施抗性的產(chǎn)生可能并非直接來源于消毒操作的誘導(dǎo)，而是受綜合性環(huán)境因素的影響，抗性的發(fā)展可能是一個更加多樣化和復(fù)雜的過程。

4 展望

病毒滅活不徹底為病原性病毒引發(fā)疾病留下風(fēng)險，而噬菌體等病毒帶來的抗性基因遷移也為人類健康留下隱患。自然界中病毒種類繁多，大部分未被人類分離培育，且易于變異，進一步探明病毒受消毒手段影響的滅活機理，在分子水平探究其滅活機制，將有助于預(yù)測非可培養(yǎng)病毒的消毒行為，并為之制定有效的消毒策略，促進消毒方法的改進。目前雖已有在結(jié)構(gòu)組成層面對病毒滅活機理的影響研究，但不同病毒蛋白所涉及的基本功能、消毒時發(fā)生在病毒基因組及衣殼蛋白等位點的修飾對病毒的具體結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生的影響等并不明確。進一步明確不同消毒手段的靶位點及消毒劑是否作用于病毒某些重要的氨基酸仍有待闡明。未來的研究中若能確定病毒哪些蛋白質(zhì)區(qū)域或基因組區(qū)域最易失活，將為病毒滅活手段的提高、水體中病原性病毒的監(jiān)測提供幫助。

對病毒聚集效應(yīng)的研究已有許多，但對病毒聚集體進行更多的研究，了解其在病毒抵抗不利環(huán)境條件中的作用、機理，將有助于優(yōu)化廢水處理系統(tǒng)，并為了解部分病毒對消毒措施擁有顯著強于其他種類病毒的抗性提供幫助。進一步明確病毒在環(huán)境壓力下的響應(yīng)機理，將有利于為病毒在不良環(huán)境下的進化方向提供預(yù)判，從而獲得應(yīng)對不同消毒措施具有強抗性病毒的先機。