徐小雯 李哲明 應(yīng)夏麗

缺血性腦卒中為血栓或栓子阻塞腦內(nèi)動脈引起的常見腦血管疾病，具有較高的疾病致殘率和病死率，溶栓及介入治療恢復(fù)阻塞腦血管血流是目前治療該病的有效手段[1-2]。腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI）發(fā)生于阻塞腦血管血流恢復(fù)再通過程中，可加重腦缺血損傷和神經(jīng)系統(tǒng)障礙，對患者腦部造成二次傷害[1，3-4]。中藥山茱萸為山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉[3]，馬錢苷是山茱萸中含量最高的環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)，是山茱萸的主要活性成分之一，具有神經(jīng)保護作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)馬錢苷能通過減少CIRI小鼠神經(jīng)細胞凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[6]，但具體作用機制還需實驗完善。因此，本研究擬通過體內(nèi)外實驗，探索馬錢苷治療CIRI的作用機制，為開發(fā)抗腦缺血損傷藥物提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及實驗試劑 成年雄性SD大鼠（250～300 g）30只購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[動物生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）2018-0006]，飼養(yǎng)于杭州鷹旸生物科技有限公司動物中心[動物使用SYXK許可證：（浙）2020-0024]，實驗批準號：EYOUNG-20210205-02。小鼠來源神經(jīng)瘤母細胞（N2a）購自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司。TNF-α、IL-6、IL-1β的ELISA檢測試劑盒（批號分別為MM-0180R2、MM-0190R2、MM-0047R2）購自江蘇酶免實業(yè)有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：CW2569）購自北京康為世紀生物科技有限公司。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）細胞毒性檢測試劑盒（批號：C0016）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染液（批號：F603BA0025）購自上海生工生物工程股份有限公司。TUNEL檢測試劑盒（批號：G1501）購自武漢賽維爾生物科技有限公司。Triton X-100（批號：HFH10）購自美國Thermo公司。二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）蛋白定量試劑盒（批號：pc0020）購自北京索萊寶科技有限公司。細胞凋亡檢測試劑盒（批號：556547）購自美國BD公司。NF-κB、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK,p38）、磷酸化-p38（pospho-p38,p-p38）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、活化Caspase-3（cleaved-Caspase-3）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）抗體（批號分別為AF5006、BF8015、AF4001、AF6311、AF7022、AF7021）購自美國Affinity公司。馬錢苷結(jié)晶（20 mg，純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司（批號：B20822），根據(jù)需要溶于純凈水備用。

1.2 實驗動物分組及模型建立 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機分為假手術(shù)組、CIRI組及CIRI+馬錢苷低、中、高劑量組，每組6只。參照Dai等[7]方法制備大鼠CIRI模型，大鼠麻醉、固定后，于頸部中線切開。分離右側(cè)的頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈。將頸外動脈結(jié)扎，夾閉其余2根動脈，從頸外動脈引入栓線緩緩?fù)迫腼B內(nèi)，1 h后取出栓線，恢復(fù)灌注24 h。以出現(xiàn)前爪不能完全伸展，身體出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)、傾倒，無法行走等表現(xiàn)為CIRI模型制備成功[8]。假手術(shù)組僅分離頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，不進行栓塞處理。CIRI+馬錢苷低、中、高劑量組按體質(zhì)量分別給予5、10、15 mg/kg馬錢苷，腹腔注射，連續(xù)給藥7 d，假手術(shù)組與CIRI組給予等體積0.9%氯化鈉溶液。

1.3 細胞分組及模型制備 N2a置于10%FBS、2 mmol/L谷氨酰胺、100 mg/L鏈霉素的改良培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2正常培養(yǎng)。隨機分為正常對照組、氧糖剝奪/復(fù)氧（oxygen and glucose deprivation reaeration,OGD/R）組及OGD/R+馬錢苷低、中、高劑量組。參照Lu等[9]方法建立OGD/R模型，取對數(shù)生長期細胞，使用脫氧無糖漢克斯平衡鹽溶液，在37℃、體積分數(shù)分別為95%氮氣和5%CO2低氧室孵育2 h進行氧剝奪。正常對照組在人工腦脊液中用10 mmol/L葡萄糖洗滌2次，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；OGD/R組和OGD/R+馬錢苷低、中、高劑量組正常氧氣條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，OGD/R+馬錢苷低、中、高劑量組的馬錢苷摩爾濃度分別為10、20、30 μmol/L。

1.4 大鼠觀測指標

1.4.1 大鼠腦組織梗死率測量 采用TTC染色法。腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）對大鼠進行深度麻醉，取出大腦稱質(zhì)量，切成1～2 mm薄片，多聚甲醛固定30 min，TTC染液孵育15 min。測量梗死區(qū)域（白色）與非梗死區(qū)（紅色）面積，計算腦梗死率（%）=腦梗死區(qū)面積/腦總面積×100%。

1.4.2 大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的檢測 采用ELISA法。大鼠頸動脈取血后，3 500 r/min離心15 min，取上清液備用。取酶標板加入各組待測樣本10 μl和40 μl稀釋液，另設(shè)置標準品孔加入50 μl標準品，每孔加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μl，溫育1 h后洗板。加入顯色劑后避光反應(yīng)，測定各孔吸光度，以空白孔作對照，計算血清樣本中IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.4.3 大鼠腦組織凋亡細胞檢測 采用TUNEL染色法。取大鼠腦組織制備石蠟切片。常規(guī)脫蠟后，修復(fù)切片，洗滌。TUNEL染液孵育標本2 h，清洗。加DAPI染液，避光孵育10 min。熒光顯微鏡下觀察綠色的TUNEL陽性的凋亡細胞，計算神經(jīng)細胞凋亡率（%）=（TUNEL陽性細胞數(shù)/視野內(nèi)細胞數(shù)）×100%。

1.4.4 大鼠腦組織Caspase-3、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2關(guān)聯(lián)X基因（Bax）mRNA表達的檢測 采用qRT-PCR法。參照試劑盒方法，每200 mg腦組織加入1 000 μl的 Trizol進行mRNA的提取，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｅ渲品磻?yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件：42℃，15 min；85℃，5 min。逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后進行實時熒光定量PCR，之后進行PCR反應(yīng)優(yōu)化，PCR反應(yīng)條件為95℃變性10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；40次循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計算腦組織內(nèi)Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA相對表達量。各引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4.5 大鼠腦組織 NF-κB、p38、p-p38、Caspase-3、cleaved-Caspase-3蛋白表達的檢測 采用Western blot法。取100 mg腦組織盡量剪碎，加入1 ml冷裂解緩沖液，制備勻漿，充分破碎后靜置于冰上裂解15～30 min。取勻漿液放入離心管中，12 000 r/min，4℃離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的離心管中，根據(jù)BCA試劑盒方法測定組織中總蛋白濃度。使用聚丙烯酰胺凝膠電泳，切下條帶后轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉孵育，清洗。加入需檢測的蛋白一抗抗體，4℃過夜孵育。室溫下振蕩，吸棄上清液，清洗3遍。5%脫脂奶粉孵育，加入二抗抗體孵育1.5 h?；瘜W發(fā)光儀顯影，以GADPH為內(nèi)參，計算大鼠腦組織內(nèi)各蛋白表達水平。

1.5 細胞觀測指標

1.5.1 N2a中LDH釋放率的測定 采用LDH法。吸取5組細胞孵育緩沖液，12 000 r/min離心15 min，取上清液轉(zhuǎn)移到新的96孔板上；用適量Tritonx-100裂解細胞。參照LDH細胞毒性檢測試劑盒方法分別檢測上清液和細胞中LDH含量，計算LDH釋放率=上清液的LDH/（上清液的LDH+細胞內(nèi)的LDH）×100%。

1.5.2 N2a凋亡的檢測 采用流式細胞術(shù)。分別取5組對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，預(yù)冷PBS緩沖液清洗，調(diào)整細胞密度為1×106/ml。加入500 μl結(jié)合緩沖液混勻細胞，離心棄上清液，加入100 μl結(jié)合緩沖液。加入 5 μl Annexin V-FITC 和 10 μl PI的凋亡試劑，室溫避光環(huán)境下反應(yīng)15 min，后加入400 μl結(jié)合緩沖液重懸細胞。流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5.3 N2a中Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達的檢測 采用qRT-PCR法。取每組1×107細胞，Trizol裂解提取總RNA。參照1.4.4操作處理樣本。采用2-ΔΔCt方法計算5組細胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax基因相對表達量。各引物序列見表2。

表2 引物序列

1.5.4 N2a中NF-κB、p38、p-p38、Caspase-3、cleaved-Caspase-3蛋白表達的檢測 采用Western blot法。取各組細胞進行裂解，離心取上清液。參照方法1.4.5操作處理樣本?；瘜W發(fā)光儀顯影，GADPH為內(nèi)參，計算5組細胞中各蛋白表達水平。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠指標觀測結(jié)果

2.1.1 5組大鼠腦組織梗死面積和梗死率的比較 與假手術(shù)組相比，CIRI組大鼠腦組織梗死面積增加，梗死率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1a（插頁）。相比CIRI組，CIRI+馬錢苷低、中、高劑量組大鼠腦梗死面積和梗死率均下降，其中CIRI+馬錢苷中、高劑量組大鼠腦梗死面積和梗死率顯著下降（P＜0.01），見圖1b（插頁）。

圖1 5組大鼠腦組織梗死面積和梗死率比較（a：腦組織梗死面積；b：腦梗死率）

2.1.2 5組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平的比較 相比假手術(shù)組，CIRI組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。相比CIRI組，CIRI+馬錢苷低、中、高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均下降，其中CIRI+馬錢苷中、高劑量組大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見表3。

表3 5組大鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-6表達的比較（ng/L）

2.1.3 5組大鼠腦組織凋亡細胞數(shù)量和凋亡率的比較 與其他4組相比，假手術(shù)組凋亡細胞數(shù)量較少，TUNEL染色僅可見極少數(shù)凋亡細胞，見圖2a（插頁）；相比其他4組，CIRI組出現(xiàn)大量凋亡細胞，細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；相比CIRI組，CIRI+馬錢苷中、高劑量組細胞凋亡率均顯著下降（均P＜0.01），見圖2b（插頁）。

圖2 5組大鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡及凋亡率比較（a：TUNEL染色，400×；b：細胞凋亡率）

2.1.4 5組大鼠腦組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達的比較 相比假手術(shù)組，CIRI組Bax、Caspase-3的mRNA相對表達量顯著升高，Bcl-2的mRNA相對表達量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。與CIRI組相比，CIRI+馬錢苷低、中、高劑量組Bcl-2的mRNA相對表達量顯著升高，Bax、Caspase-3的mRNA相對表達量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖3。

圖3 大鼠腦組織中Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表達的比較

2.1.5 5組大鼠腦組織中NF-κB、p38、p-p38、Caspase-3、cleaved-Caspase-3蛋白表達的比較 相比假手術(shù)組，CIRI組 NF-κB、p-p38/p38和 cleaved-Caspase-3/Caspase-3蛋白相對表達量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；相比CIRI組，CIRI+馬錢苷低、中、高劑量組NF-κB、p-38/p38和cleaved-Caspase-3/Caspase-3蛋白相對表達量均降低，其中CIRI+馬錢苷中、高劑量組NF-κB、p-p38/p38和cleaved-Caspase-3/Caspase-3蛋白相對表達量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖4。

圖4 大鼠腦組織中NF-κB、p38、p-p38、Caspase-3、cleaved-Caspase-3蛋白表達的比較（a：NF-κB、p-p38/p38、cleaved-Caspase-3/Caspase-3蛋白表達水平；b：蛋白電泳圖）

2.2 細胞指標觀測結(jié)果

2.2.1 5組N2a LDH釋放率的比較 相比正常對照組，OGD/R組LDH釋放率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；相比OGD/R組，OGD/R+馬錢苷低、中、高劑量組LDH釋放率均降低，其中OGD/R+馬錢苷中、高劑量組LDH釋放率均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見圖5。

圖5 5組N2a LDH釋放率的比較

2.2.2 5組N2a細胞凋亡率的比較 相比于正常對照組，OGD/R組細胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；相比于OGD/R組，OGD/R+馬錢苷中、高劑量組細胞凋亡率均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見圖6。

圖6 5組N2a細胞凋亡和凋亡率比較（a1～a5：流式細胞術(shù)檢測凋亡細胞；b：5組細胞凋亡率）

2.2.3 5組N2a中Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達的比較 與正常對照組相比，OGD/R組Bax、Caspase-3的mRNA相對表達量均顯著升高，Bcl-2的mRNA相對表達量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。相比OGD/R組，OGD/R+馬錢苷低、中、高劑量組Bcl-2表達均顯著升高，Bax、Caspase-3相對表達量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖7。

圖7 5組N2a Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表達的比較

2.2.4 5組 N2a中 NF-κB、p38、p-p38、Caspase-3、cleaved-Caspase-3蛋白表達的比較 相比正常對照組，OGD/R組細胞中NF-κB、p-p38/p38和cleaved-Caspase-3/Caspase-3蛋白相對表達量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。相比OGD/R組，OGD/R+馬錢苷中、高劑量組NF-κB、p-p38/p38和cleaved-Caspase-3/Caspase-3蛋白相對表達量均顯著降低（均P＜0.05），見圖8。

圖8 5組N2a NF-κB、p38、p-p38、Caspase-3、cleaved-Caspase-3蛋白表達的比較（a：NF-κB、p-p38/p38、cleaved-Caspase-3/Caspase-3蛋白表達水平；b：蛋白電泳圖）

3 討論

缺血性腦卒中治療過程中出現(xiàn)的再灌注損傷（reperfusion injury,R/I）對腦組織及腦神經(jīng)元的恢復(fù)影響極大，是目前治療缺血性腦疾病過程中的主要障礙，有效減輕R/I對于CIRI治療具有重要臨床意義。許多中藥被報道能夠改善CIRI[8，10-11]。而馬錢苷在阿爾茲海默病、帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療和神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)中的作用提示其對CIRI可能存在保護作用[1]。

線栓法是制備CIRI大鼠模型的常用方法之一，實驗效果較好[12]。本研究采用線栓法令大鼠右側(cè)腦部缺血1 h后再進行血流灌注24 h，灌注后大鼠出現(xiàn)身體傾向?qū)?cè)一邊，對側(cè)前肢不能伸展等典型癥狀，表明CIRI大鼠模型制備成功[13]。R/I的炎癥反應(yīng)可加重腦組織損傷，研究表明促炎性細胞因子如TNF-α、IL-6等水平升高加重腦血管收縮，加劇血腦屏障破壞，不利于腦組織損傷的恢復(fù)[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組大鼠相比，CIRI大鼠的腦梗死面積和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎性細胞因子水平顯著升高，而不同劑量馬錢苷干預(yù)后大鼠腦梗死情況和炎癥反應(yīng)均得到改善，其中以CIRI+馬錢苷中、高劑量組的改善效果最為顯著。OGD/R是體外模擬缺血再灌注損傷模型的方法之一，其模擬效果接近人體的病理生理狀態(tài)，細胞外LDH釋放量可用于反映細胞損傷程度[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，N2a經(jīng)OGD/R造模后細胞LDH釋放率顯著增加，表明細胞損傷程度嚴重；而OGD/R+馬錢苷中、高劑量組細胞LDH釋放率顯著減少，表明馬錢苷能夠減輕R/I引起的神經(jīng)細胞損傷。

細胞凋亡是基因控制的存在于生物體內(nèi)的細胞程序性死亡過程，是 CIRI的發(fā)病機制之一[6，10，18]。Bcl-2和Bax同屬Bcl-2蛋白家族成員，兩者在細胞凋亡中分別扮演抑制和促進凋亡的角色，cleaved-Caspases-3是Caspases-3的活化形式，是細胞凋亡程序的主要執(zhí)行者[16]。研究表明馬錢苷可通過下調(diào)腦組織缺血區(qū)域Caspase-3蛋白表達，減少腦組織R/I的神經(jīng)細胞凋亡[6]。本研究使用Tunel染色和流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，CIRI大鼠神經(jīng)細胞和OGD/R誘導(dǎo)后的N2a凋亡數(shù)量增加，不同劑量馬錢苷干預(yù)后細胞凋亡數(shù)量顯著減少，提示馬錢苷可抑制R/I引起的神經(jīng)細胞凋亡。CIRI大鼠腦組織和OGD/R誘導(dǎo)后的N2a中Bcl-2 mRNA表達均顯著降低，Bax、Caspase-3 mRNA表達均顯著增加，與王玉等[19]研究結(jié)果一致；在不同劑量馬錢苷干預(yù)后，CIRI大鼠腦組織和OGD/R誘導(dǎo)后的N2a中 Bcl-2 mRNA表達均增加，Bax、Caspase-3 mRNA表達均降低，推測馬錢苷通過促進Bcl-2表達、抑制Bax和Caspase-3表達從而抑制體內(nèi)外R/I的神經(jīng)細胞凋亡。

NF-κB是調(diào)控細胞炎癥反應(yīng)、增殖以及凋亡的重要因子之一[20]，腦組織缺血損傷可引起NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活[21-22]。p38可在腦缺血組織中被激活，引起NF-κB轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)神經(jīng)細胞發(fā)生炎癥反應(yīng)和凋亡，因此阻斷p-p38/NF-κB通路可減輕腦梗死的炎癥損傷[21]。研究表明，NF-κB/p38通路在肺缺血R/I中介導(dǎo)炎癥介質(zhì)釋放，引起器官功能障礙[23]。庫亞萍等[24]研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB/p38 MAPK通路在CIRI大鼠腦組織中表達上調(diào)，而下調(diào)該通路表達能夠減輕大鼠腦組織炎癥反應(yīng)。既往研究表明，馬錢苷可抑制NF-κB和p-38蛋白表達，促進神經(jīng)細胞活力，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，p-p38/p38和NF-κB在CIRI大鼠腦組織和CIRI細胞中的相對表達量均顯著升高，而不同劑量馬錢苷處理后，p-p38/p38和NF-κB表達均降低，提示馬錢苷在體內(nèi)外可通過抑制p38/NF-κB信號通路改善I/R后的炎癥損傷作用。

綜上所述，馬錢苷在體內(nèi)外對R/I的神經(jīng)細胞具有改善作用，其作用是通過調(diào)控NF-κB/p38信號通路減少炎性介質(zhì)釋放、抑制神經(jīng)細胞凋亡來實現(xiàn)的。