趙玉杰 吳巧萍 龔夢帥 秦玲

鮑曼不動桿菌是全球院內(nèi)感染的重要致病菌，臨床上可引起呼吸機相關(guān)性肺炎及神經(jīng)系統(tǒng)感染等各種危重感染并迅速傳播[1]。隨著醫(yī)療水平和診療技術(shù)的發(fā)展，近年來，鮑曼不動桿菌耐藥問題日益凸顯，2020年中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)報告顯示，鮑曼不動桿菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為68.1%和69.0%[2]。多黏菌素B（polymyxin B,PB）是治療由多重耐藥革蘭陰性菌引起嚴(yán)重感染的最后一道防線，由于臨床使用量增多，PB耐藥鮑曼不動桿菌陸續(xù)被分離，其耐藥機制成為當(dāng)前關(guān)注的熱點研究[3-4]。研究表明，細(xì)菌耐藥性的形成與外排泵過度表達(dá)關(guān)系密切[5]。鮑曼不動桿菌中介導(dǎo)多藥耐藥的主要外排泵為耐藥結(jié)節(jié)細(xì)胞分化（resistance-nodulation-cell division,RND）家族和多藥及毒性化合物外排（multidrug and toxic compound extrusion,MATE）家族，RND家族包括Ade-ABC、AdeIJK、AdeFGH和AdeDE等4種外排泵及其相關(guān)調(diào)控系統(tǒng)，adeB、adeJ、adeG和adeE分別為相應(yīng)的內(nèi)膜蛋白，在外排泵系統(tǒng)中發(fā)揮主要的功能作用[6]，其中，AdeABC是鮑曼不動桿菌最重要的外排泵。AbeM是MATE家族的主要外排泵，涉及細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、毒力因子和有毒化合物的排出等，功能十分廣泛[7]。目前，鮑曼不動桿菌RND和MATE家族外排泵系統(tǒng)與PB耐藥性的關(guān)系尚不明確。本研究通過探究體外誘導(dǎo)PB耐藥鮑曼不動桿菌外排泵表達(dá)與PB耐藥的關(guān)系，為PB的耐藥機制研究提供新的視角，為新型佐劑研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院2020年1月—2021年12月共分離到多重耐藥鮑曼不動桿菌300株，剔除相關(guān)重復(fù)菌株后，均經(jīng)過VITEK 2 Copmpact全自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定。標(biāo)準(zhǔn)菌株鮑曼不動桿菌ATCC19606購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫，質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922由本院實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 PB（批號：2007CT1275）購自溫州康泰生物技術(shù)有限公司；羰基氰氯苯腙（carbonyl cyanide mchlorophenylhydrazine,CCCP）（批號：27674）、總 RNA抽提試劑盒（Trizol）（批號：U8831）購自杭州天根科技有限公司；PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：AJ60652A）和TB Green qRT-PCR試劑盒（批號：AM61527A）均購自大連寶生物工程有限公司；2×Taq PCR MasterMix（批號：AL14585A）購自美谷生物科技浙江有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PB敏感性檢測 采用微量肉湯稀釋法檢測菌株對PB的最低抑菌濃度（minimal inhibit concentration,MIC）。具體步驟如下：吸取100 μl PB藥液（256 mg/L）加至滅菌96孔板的第1列，用陽離子校正的MH肉湯對倍稀釋成系列濃度。用新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌調(diào)0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，?jīng)0.9%氯化鈉溶液稀釋100倍后加入96 孔板，每孔100 μl，貼膜覆蓋，37 ℃孵育16～18 h，以完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC值，大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株。參考2019年CLSI標(biāo)準(zhǔn)，菌株對PB的MIC值≤2 mg/L為敏感，≥4 mg/L為耐藥。

1.2.2 體外誘導(dǎo)PB耐藥試驗 在PB的MIC值為＜0.030 0、0.030 0、0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0和2.000 0 mg/L的敏感菌株中各選取3株共24株敏感菌進(jìn)行PB耐藥誘導(dǎo)試驗，以成功誘導(dǎo)耐藥的菌株作為耐藥組，未經(jīng)誘導(dǎo)的相同菌株為敏感組。按文獻(xiàn)[8]方法，將新鮮培養(yǎng)過夜的離株單菌落置于LB肉湯培養(yǎng)基中37℃震蕩過夜，取菌懸液加入含有1/2×、1×、2×和4×MIC PB藥物濃度的96孔板中，隔24 h后傳代至新鮮的含更高梯度濃度PB藥液的96孔板中，共誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d。以不含抗菌藥物正常培養(yǎng)的相同菌株為空白對照。每次轉(zhuǎn)移前將該孔中菌懸液接種至血平板觀察污染情況，將未受到污染的單菌落保存于30%甘油肉湯中用于后續(xù)檢測。

1.2.3 外排泵表型檢測 二甲基亞砜溶解CCCP粉末，配置成終濃度為10 mg/L的CCCP溶液[9]。制備0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙海?.9%氯化鈉溶液稀釋100倍備用。按照1.2.2方法制備系列濃度的PB藥液，每孔中分別加入CCCP溶液和菌懸液，37℃孵育16～18 h，以完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC值，對比加入CCCP后PB的MIC值變化。若加入CCCP后菌株對PB的MIC值下降≥4倍，則判定為外排泵陽性菌株[10]。

1.2.4 外排泵基因擴增及測序 采用煮沸法提取耐藥組和敏感組菌株的基因組DNA。挑取2～3個對數(shù)生長期單菌落置于EP管，加入無菌雙蒸水，混合均勻后置100℃沸水中煮沸10 min，8 000 r/min離心30 s，吸取上清液，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用PCR法擴增外排泵基因，包括操縱子基因adeB及其調(diào)控基因adeR和adeS、adeJ及其調(diào)控基因adeN、adeG及其調(diào)控基因adeL、操縱子基因adeE和abeM，各引物序列見表1[11]。PCR反應(yīng)體系：2× Taq PCR MasterMix 12.5 μl，Primer F（10 μmol/L）0.5 μl，Primer R（10 μmol/L）0.5 μl，模板1.0 μl，雙蒸水 10.5 μl。伯樂 C1000 型 PCR 儀擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察特異性擴增條帶，調(diào)控基因陽性擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序。將得到的序列通過國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）數(shù)據(jù)庫找到標(biāo)準(zhǔn)序列，利用SnapGene軟件進(jìn)行序列比對分析，找出基因突變位點。

表1 PCR引物序列

1.2.5 外排泵基因表達(dá)水平的檢測 分別將耐藥組和敏感組細(xì)菌接種于MH肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，采用Trizol法提取菌株的總RNA，PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄出cDNA，參照TB Green qRT-PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性8 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，反應(yīng)共40個循環(huán)，通過相對定量法（2-ΔΔCt）計算各基因相對表達(dá)量，以鮑曼不動桿菌ATCC19606為對照菌株，以rpoB為內(nèi)參基因。引物序列見表2。

表2 qRT-PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件。耐藥組添加CCCP前后的MIC值比較采用Wilcoxon秩和檢驗。耐藥組和敏感組間外排泵基因的相對表達(dá)量比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PB敏感性分析 分離到的300株鮑曼不動桿菌均對PB敏感，未發(fā)現(xiàn)PB耐藥株。其中MIC值＜0.0300mg/L的菌株最多（84株，28.0%），其他依次為0.500 0 mg/L 59株（19.7%）、1.000 0 mg/L 52株（17.3%）、0.030 0 mg/L 36株（12.0%）、0.125 0 mg/L 20株（6.7%）、0.062 5 mg/L 18株（6.0%）、2.000 0 mg/L 17株（5.6%）和0.250 0 mg/L 14株（4.7%）。

2.2 誘導(dǎo)耐藥試驗結(jié)果 8個MIC值下隨機選定的24個菌株中，共誘導(dǎo)耐藥成功12株，其中＜0.030 0和0.030 0 mg/L未誘導(dǎo)成功，0.062 5 mg/L誘導(dǎo)成功1株（菌株號：14244），0.125 0 mg/L誘導(dǎo)成功2株（菌株號：14491、14202），0.250 0 mg/L誘導(dǎo)成功3株（菌株號：14520、14600和14304），0.500 0 mg/L誘導(dǎo)成功3株（菌株號：14359、14267和14260），1.000 0 mg/L誘導(dǎo)成功2株（菌株號：14393、14297），2.000 0 mg/L誘導(dǎo)成功1株（菌株號：14433）。

2.3 外排泵表型檢測結(jié)果 耐藥組加入CCCP后，PB的MIC值與添加前相比明顯下降，下降幅度8～256倍，判斷為外排泵表型陽性株。耐藥組經(jīng)CCCP處理前后對PB MIC值的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表3。

表3 耐藥組加入CCCP前后MIC值的變化情況

2.4 外排泵基因攜帶情況及序列比對結(jié)果 12株耐藥菌株中有11株攜帶adeB，攜帶率為91.67%，所有菌株均攜帶adeJ、adeG和abeM，未檢出adeE攜帶株，見圖2。序列比對結(jié)果顯示，菌株14433不攜帶adeR和adeS操縱子基因；菌株14359不攜帶adeR基因，攜帶的adeS基因出現(xiàn)A153T、G186V等2個突變位點；菌株14267不攜帶adeS基因，攜帶的adeR基因出現(xiàn)V120I、A136V等突變位點；其他8個菌株均出現(xiàn)adeR基因的V120I、A136V突變和adeS基因的A153T、G186V突變，見表4。adeN和adeL未檢出突變位點。

表4 耐藥組adeR和adeS調(diào)控基因突變情況

圖2 PB耐藥株外排泵操縱子攜帶基因檢測結(jié)果

2.5 外排泵基因相對表達(dá)量比較 耐藥組和敏感組外排泵基因的表達(dá)水平均呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)。與敏感組相比，耐藥組adeB的相對表達(dá)量增加了2.2倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），adeJ、adeG和abeM分別增加1.9倍、1.8倍和1.8倍（均P＞0.05），見圖3。

圖3 耐藥組和敏感組外排泵基因相對表達(dá)量比較（a：adeB，n=11；b：adeJ，n=12；c：adeG，n=12；d：abeM，n=12）

3 討論

鮑曼不動桿菌是一種耐藥性和生存能力都較強的革蘭陰性桿菌，廣泛分布在醫(yī)療環(huán)境中，隨著各種抗菌藥物在臨床上大量不合理的使用，多重耐藥鮑曼不動桿菌的檢出率逐年增加，給臨床治療帶來極大困擾。多重耐藥菌通常選擇PB、替加環(huán)素或聯(lián)合用藥進(jìn)行治療[12]。隨著PB耐藥鮑曼不動桿菌的增多，外排系統(tǒng)的活化成為鮑曼不動桿菌固有和獲得性耐藥的重要機制，其表達(dá)在PB耐藥鮑曼不動桿菌中的作用研究亟待展開。

本研究檢測了分離出的300株多重耐藥鮑曼不動桿菌對PB的敏感性，未檢測到耐藥株，體外誘導(dǎo)獲得12株P(guān)B耐藥株。在誘導(dǎo)試驗中發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動桿菌長期暴露在亞抑制濃度的PB中，易轉(zhuǎn)變?yōu)镸IC值逐漸升高的耐藥菌，升高的幅度存在個體差異性，推測與不同個體菌株適應(yīng)性突變和進(jìn)化的機制不同有關(guān)[13]。鑒于藥動學(xué)-藥效學(xué)效應(yīng)和人體組織滲透性差異等機制的作用，人體組織內(nèi)的細(xì)菌長期處于亞致死濃度范圍，為確保生存，細(xì)菌會通過發(fā)生適應(yīng)性突變來不斷獲得耐藥[14]。提示臨床應(yīng)謹(jǐn)慎合理使用抗菌藥物，防止病原菌發(fā)生適應(yīng)性進(jìn)化而耐藥。

CCCP是常見的外排泵抑制劑，可阻斷主動外排系統(tǒng)的能量來源，增加藥物在細(xì)菌中的積累，恢復(fù)細(xì)菌對藥物的敏感性[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，添加CCCP后PB耐藥株的MIC值下降8～256倍，與添加前相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示PB耐藥株的MIC值升高與外排泵作用機制有關(guān)。添加CCCP后菌株14202對PB的MIC值仍較高（2 mg/L），推測其可能合并其他耐藥機制引發(fā)耐藥。近年來研究發(fā)現(xiàn)，AdeABC和AdeIJK外排泵的表達(dá)量升高與黏菌素耐藥有關(guān)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，PB耐藥株中外排泵基因adeB、adeJ、adeG和abeM均有較高的攜帶率，未檢測到adeE，與相關(guān)研究中認(rèn)為AdeABC無法與其共存結(jié)果一致[16]。序列比對分析發(fā)現(xiàn)，攜帶調(diào)控基因adeR和adeS的PB耐藥株均出現(xiàn)了2～4個突變位點，與敏感組相比，adeB的相對表達(dá)量增加了2.2倍（P＜0.05）。研究表明，AdeABC外排泵系統(tǒng)過表達(dá)引發(fā)多種抗菌藥物的耐藥性增加，其機制是AdeRS雙組分調(diào)控系統(tǒng)（two-component regulatory system,TCS）的點突變、缺失或插入序列導(dǎo)致[17]。Yilmaz等[18]研究證實，adeB攜帶株出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)與AdeRS TCS發(fā)生點突變進(jìn)而導(dǎo)致PB耐藥顯著相關(guān)，Sun等[19]通過基因敲除構(gòu)建鮑曼不動桿菌的adeRS突變體缺失株，與親本株的對比分析發(fā)現(xiàn)，adeRS缺失株對PB和洗必泰等抗菌藥物更敏感，說明AdeRS TCS可能通過點突變的方式直接或間接影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及其通透性，進(jìn)而阻礙PB進(jìn)入外膜，導(dǎo)致耐藥性升高，與本研究相符。另外，菌株14304未攜帶adeB，仍檢出adeR和adeS的點突變，推測AdeRS TCS在調(diào)控外排泵基因表達(dá)時存在調(diào)控功能的多樣性，菌株14433未檢出突變，仍顯現(xiàn)出外排泵陽性表型，可能和其他外排泵調(diào)控系統(tǒng)有關(guān)，值得進(jìn)一步探索研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，與敏感組相比，PB耐藥組adeJ、AadeG和abeM基因相對表達(dá)量亦有不同程度上調(diào)（P＞0.05）。AdeIJK外排泵由位于AdeIJK上游的tetR型調(diào)控子adeN調(diào)控，adeN失活可導(dǎo)致adeJ的表達(dá)水平提高，并由此降低細(xì)菌對多種抗菌藥物的敏感性[20]。有研究認(rèn)為，AdeIJK通常介導(dǎo)細(xì)菌內(nèi)源性耐藥，表達(dá)過高對細(xì)菌本身是致死性的損害，與AdeABC外排泵具有協(xié)同增效作用，兩種泵中任何一種表達(dá)上調(diào)均可導(dǎo)致抗菌藥物敏感性下降[21]。AdeFGH通常受其上游調(diào)控基因adeL的調(diào)控，adeL基因的點突變、插入或缺失突變均會導(dǎo)致下游adeG高表達(dá)，增強AdeFGH的外排功能，介導(dǎo)多重耐藥發(fā)生。本研究均未檢測到adeL和adeN基因的突變，說明AdeFGH和AdeIJK的表達(dá)還受其他調(diào)控基因的調(diào)控。AbeM與鮑曼不動桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606的NorM同源性達(dá)70%，其通常以質(zhì)子驅(qū)動力為主要能量將藥物排出體外，據(jù)報道其主動外排的底物涉及多種抗菌藥物[22]，本研究中耐藥組的abeM表達(dá)量出現(xiàn)一定程度的上調(diào)，推測與PB耐藥具有一定相關(guān)性。

外排泵系統(tǒng)在細(xì)菌耐藥方面發(fā)揮著獨特的作用，其任何變化都可能影響抗生素耐藥性。本研究中，細(xì)菌獲得PB耐藥后，RND和MATE家族不同的外排泵基因及部分調(diào)控基因均參與了PB耐藥表型的發(fā)生，由于外排泵具有廣泛底物外排特性及相互之間對耐藥機制貢獻(xiàn)的復(fù)雜性，推測多種外排泵系統(tǒng)的聯(lián)合作用影響PB的抗菌效果。加強外排泵與PB耐藥的相關(guān)機制研究，積極研發(fā)新型外排泵抑制劑，可有效控制外排泵系統(tǒng)活動變化導(dǎo)致的耐藥現(xiàn)象，同時，嚴(yán)格控制抗菌藥物的不合理使用、避免敏感菌發(fā)展為耐藥菌仍是重中之重，臨床醫(yī)師應(yīng)引起高度重視。