曹恩棟 呂志異 蔡海平 鄭建濤 楊勇 張緒超 周德祥

惡性膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)特性是活躍增殖和侵襲性生長，手術(shù)治療無法做到病理學(xué)全切除，經(jīng)綜合治療后仍容易復(fù)發(fā)及預(yù)后不良，研究與膠質(zhì)瘤增殖與侵襲有關(guān)的基因具有重要研究意義。包含Jumonji C結(jié)構(gòu)域蛋白6（Jumonji C-domain containing protein 6, JMJD6）是JmjC家族成員，具有組蛋白精氨酸去甲基化酶和賴氨酸羥基化酶活性，與腫瘤的發(fā)生、增殖、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移等行為有關(guān)[1-3]。既往研究表明JMJD6具有促進膠質(zhì)瘤細胞增殖與侵襲的作用，抑制JMJD6可延長膠質(zhì)瘤動物模型的生存期及改善預(yù)后[4]，但JMJD6在不同病理級別膠質(zhì)瘤之間表達的差異及其相關(guān)性如何還有待研究。Ki67是一種存在于增殖細胞核中，與細胞增殖相關(guān)的抗原，是評價腫瘤細胞增殖活性的重要標志物，Ki67的表達程度隨著膠質(zhì)瘤惡性度的增高而升高，與膠質(zhì)瘤病例級別呈正相關(guān)[5-6]。本研究旨在探討JMJD6與Ki67在各級別膠質(zhì)瘤中的表達情況，并進一步分析JMJD6與Ki67和病理級別三者的相互相關(guān)性，為JMJD6成為膠質(zhì)瘤潛在靶點和抑制膠質(zhì)瘤增殖方面的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 從2018至2020年我科收治的膠質(zhì)瘤患者中，按病理級別及各級別發(fā)病率隨機抽取46例，Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級每個級別10例，Ⅳ級16例，去除Ⅱ級和Ⅳ級掉片各2例，列入最后統(tǒng)計共42例，其中，Ⅰ級10例、Ⅱ級8例、Ⅲ級10例、Ⅳ級14例（按膠質(zhì)瘤WHO分級標準2016版），按病理級別分為四個組：Ⅰ級組、Ⅱ級組、Ⅲ級組和Ⅳ級組。病理診斷及例數(shù)分布：毛細胞型星形細胞瘤10例，毛粘液型星形細胞瘤1例，彌漫型星形細胞瘤4例，少突膠質(zhì)細胞瘤2例，多形性黃色星形細胞瘤1例，間變星形細胞瘤2例，間變多形性黃色星形細胞瘤2例，間變少突膠質(zhì)細胞瘤6例，膠質(zhì)母細胞瘤14例。材料和試劑：兔抗人JMJD6單克隆抗體（購于廣州碩恒生物科技有限公司）、兔抗人單克隆抗體 Ki67、SP 試劑盒及 DAB 顯色試劑盒均來自廣州捷威斯生物科技有限公司。

1.2 膠質(zhì)瘤組織中JMJD6與Ki67蛋白檢測 免疫組化染色均采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（Streptavidin-Perosidase，SP）法，每個標本連續(xù)切取3張4μm厚切片，常規(guī)脫臘至水。采用SP二步法進行免疫組化染色，操作步驟參照試劑盒說明書進行，微波修復(fù)抗原，以PBS代替一抗染色作為陰性對照。

1.3 免疫組化染色定性、定量判斷 JMJD6蛋白的定性分析：JMJD6蛋白的表達定位在細胞核內(nèi)，細胞核內(nèi)無黃染為陰性表達，淡黃色為弱陽性表達，棕黃色為陽性表達，棕褐色為強陽性表達。JMJD6檢測結(jié)果按照陽性細胞數(shù)百分比評分分為5級：≤5%為0分；＞5%～25%為1分；＞25%～≤50%為2分；＞50%～75%為3分；＞75% 4分。根據(jù)細胞染色強度評分分為4級：陰性為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。陽性細胞百分比評分×細胞染色強度評分=染色指數(shù)積分。分析數(shù)據(jù)時，染色指數(shù)積分 0分為-，1～4分+，5～8分++，9～12分+++[1]。JMJD6的定量表達用染色指數(shù)積分表示。Ki67蛋白的定性分析：Ki67蛋白的表達定位在細胞核內(nèi)，核內(nèi)呈淡黃色為弱陽性表達，棕黃色為陽性表達，棕褐色為強陽性表達。陽性細胞數(shù)比例：15%以下為+，15%～30%++，30%以上為+++。Ki67蛋白的定量分析：高倍鏡（×400）下，隨機選取5個高倍視野，每個視野計數(shù)200個瘤細胞，計算其陽性細胞所占百分比，取均值作為該例患者的Ki67定量值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 25.0及 GraphPad Prism 7 統(tǒng)計分析。腫瘤組織中JMJD6、Ki67的陽性表達率采用單因素χ2檢驗；JMJD6、Ki67蛋白表達水平采用Kruskal-Wallis檢驗；JMJD6、Ki67與病理級別的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，關(guān)聯(lián)系數(shù)以rs表示，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 JMJD6與Ki67在不同級別膠質(zhì)瘤中的定性表達 JMJD6在膠質(zhì)瘤中的表達因病理級別的不同而異，Ⅰ級呈陰性或弱陽性，未見陽性或強陽性表達；Ⅱ級的表達較多樣性，陰性、弱陽性、陽性均可見；Ⅲ級以陽性為主，少數(shù)弱陽性或強陽性；Ⅳ級以陽性及強陽性表達為主，弱陽性極少（圖1，表1）；Ki67在膠質(zhì)瘤中的表達也與病理級別有關(guān)，Ⅰ級以弱陽性為主；Ⅱ級大多數(shù)弱陽性，少數(shù)為陽性；Ⅲ級以陽性為主，部分強陽性，極少弱陽性；Ⅳ級以強陽性為主，少數(shù)為陽性；JMJD6和Ki67的陽性強度均隨著病理級別的升高而增高（JMJD6：χ2=30.875，P＜0.001；Ki67：χ2=35.292，P＜0.001）（圖2，表1）。

表1 JMJD6在不同級別膠質(zhì)瘤組織中的表達差異

圖1 各級別膠質(zhì)瘤中JMJD6的定性表達 A，Ⅰ級膠質(zhì)瘤中常見JMJD6呈陰性表達（×400）；B，Ⅱ級膠質(zhì)瘤中多見JMJD6呈弱陽性表達（×400）；C，Ⅲ級膠質(zhì)瘤中多見JMJD6呈陽性表達（×400）；D，Ⅳ級膠質(zhì)瘤中多見JMJD6呈強陽性表達（×400）。

圖2 Ki67在不同級別膠質(zhì)瘤中的定性表達×400 A，Ⅰ、Ⅱ級膠質(zhì)瘤常見Ki67呈（+）；B，Ⅲ級膠質(zhì)瘤中多見Ki67呈（++）；C，Ⅳ級膠質(zhì)瘤中多見Ki67呈（+++）。

2.2 JMJD6與Ki67在不同級別膠質(zhì)瘤中的定量分析 JMJD6與Ki67的表達水平不滿足正態(tài)性和方差齊性，JMJD6表達的中位數(shù)為Ⅰ級0.05，Ⅱ級4.50，Ⅲ級7.50，Ⅳ級8.00，JMJD6的表達水平隨著膠質(zhì)瘤級別的增加而升高，級別間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（H=25.397，P＜0.001）（圖 3，表 2）。Ki67表達的中位數(shù)為Ⅰ級0.010，Ⅱ級0.050，Ⅲ級0.325，Ⅳ級0.550，Ki67的表達水平也隨著膠質(zhì)瘤級別的增加而升高，級別間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（H=30.804，P＜0.001）（圖4，表2）。

表2 不同級別膠質(zhì)瘤JMJD6、Ki67的表達水平的差異

2.3 JMJD6和Ki67與膠質(zhì)瘤病理級別的相互相關(guān)性分析 JMJD6的表達水平與膠質(zhì)瘤級別間呈正相關(guān)（r=0.782，P＜0.001）（圖3）；Ki67的表達水平與膠質(zhì)瘤級別間呈正相關(guān)（r=0.852，P＜0.001）（圖4）；膠質(zhì)瘤中JMJD6與Ki67的表達水平也呈正相關(guān)（r=0.709，P＜0.001）（圖5）。

圖3 各級別膠質(zhì)瘤中JMJD6的表達水平（中位數(shù)）的趨勢 JMJD6的表達水平與膠質(zhì)瘤級別間呈正相關(guān)（r=0.782，P ＜0.001）。

圖4 各級別膠質(zhì)瘤中Ki67表達水平（中位數(shù)）的趨勢及差異Ki67的表達水平與膠質(zhì)瘤級別間呈正相關(guān)（r=0.852，P＜0.001）。

圖5 膠質(zhì)瘤中JMJD6與Ki67表達的相關(guān)性分析 膠質(zhì)瘤中JMJD6與Ki67的表達水平呈正相關(guān)（r=0.709，P＜0.001）。

3 討論

JMJD6是一個具有賴氨酸羥化酶活性和酪氨酸激酶活性雙重作用的加氧酶，既發(fā)揮催化賴氨酸的羥基化和精氨酸組蛋白與非組蛋白多肽的乙基化作用[1-2]，也起內(nèi)在的酪氨酸激酶活性作用[3]。JMJD6作為一個癌基因，與許多惡性腫瘤的發(fā)生、增殖、遷移、侵襲等惡性生物學(xué)行為有關(guān)[7-10]。JMJD6參與膠質(zhì)瘤的形成[4]，且與膠質(zhì)瘤干細胞的增殖與侵襲有關(guān)[11]。本研究結(jié)果顯示，JMJD6在膠質(zhì)瘤中的表達水平與膠質(zhì)瘤病理級別密切相關(guān)，雖然可以表現(xiàn)為陰性、弱陽性、陽性及強陽性表達。但是，隨著病理級別的遞增，JMJD6的表達水平也呈逐漸升高趨勢，在各級別膠質(zhì)瘤的表達不全相同，JMJD6的表達水平與病理級別相關(guān)性分析結(jié)果也提示兩者存在正相關(guān)。上述兩方面研究結(jié)果均說明JMJD6與膠質(zhì)瘤的病理性質(zhì)即惡性程度密切相關(guān)。由此，可預(yù)測JMJD6與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后可能存在相關(guān)性，這值得我們下一步進一步深入探討。當然，我們也發(fā)現(xiàn)在Ⅱ級別膠質(zhì)瘤中JMJD6的表達呈現(xiàn)多樣，陰性表達、低表達及高表達均可見，有可能是Ⅱ級別入組例數(shù)少，存在誤差，也可能是以前病理級別分型采用上一個舊版本分級，該舊版本中有少數(shù)Ⅱ級別膠質(zhì)瘤，如進一步檢查H3K27M（+），則在2021年新版本分型中歸入Ⅳ級，因此，也可能產(chǎn)生誤差。本研究為回顧性分析，無法采用最新版本分級，是本研究的不足之處。

既往研究表明JMJD6與肺癌、乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤的預(yù)后呈負相關(guān)[12-13]。抑制JMJD6可抑制惡性腫瘤的增殖與侵襲[14]；且抑制JMJD6可提高腫瘤動物模型的生存時間[15]。較多證據(jù)提示JMJD6有可能成為惡性腫瘤的潛在治療靶點[16-17]。也有研究提示JMJD6與膠質(zhì)瘤的形成有關(guān)[4]，且可促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞的增殖與侵襲[11]，由于膠質(zhì)瘤干細胞是導(dǎo)致膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)、放化療耐藥、增殖、侵襲等行為的重要原因之一。因此，抑制JMJD6可能起抑制膠質(zhì)瘤干細胞的作用，從而抑制膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)、增殖生長、侵襲等惡性行為。因此，JMJD6除了可預(yù)測膠質(zhì)瘤惡性程度及增殖指數(shù)外，暗示其可能是個潛在治療靶點，這值得下一步深入研究。

Ki67是一種存在于細胞核，與細胞增殖密切相關(guān)的核蛋白。Ki67的表達反映細胞核增殖活性，自細胞進入G1期開始表達，在G2、M期表達最強，G0期不表達。目前，成為檢測細胞增殖指數(shù)的指標。作為評價增殖細胞的經(jīng)典標記物[18]，主要用于判斷腫瘤細胞的增殖活性，Ki67的陽性率越高，說明處于增殖周期的細胞比例越高，腫瘤生長越快；一般來說，Ki67的陽性率越高，其預(yù)后越差[19]。

本研究結(jié)果表明，Ki67的表達水平隨著膠質(zhì)瘤級別的增高而升高，在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達呈現(xiàn)不全相同，Ki67的表達水平與病理級別進行相關(guān)性分析結(jié)果也顯示兩者呈正相關(guān)。兩個研究結(jié)果與既往文獻研究結(jié)果是一致的[18]，可以認為，Ki67能夠作為膠質(zhì)瘤組織病理分級及預(yù)測預(yù)后的客觀指標。

JMJD6與Ki67這兩個與增殖有關(guān)的標記物，兩者的表達水平均隨著膠質(zhì)瘤級別的增高而升高，兩者與病理級別均呈顯著正相關(guān)。在進一步對JMJD6與Ki67兩者的表達水平進行相關(guān)性分析顯示兩者的表達水平也呈顯著正相關(guān)關(guān)系，說明JMJD6和Ki67在促進膠質(zhì)瘤惡性增殖方面可能存在相互作用關(guān)系或協(xié)同作用關(guān)系；再次提示兩者均可能是膠質(zhì)瘤病理分級和預(yù)測預(yù)后的客觀指標。

本研究僅探討JMJD6和Ki67在各級別膠質(zhì)瘤中的表達及三者的相互相關(guān)性，但未闡明JMJD6和Ki67對膠質(zhì)瘤增殖情況的影響及JMJD6和Ki67對膠質(zhì)瘤預(yù)后的關(guān)系，這是本研究的不足之處，我們將在以后的研究中進一步深入探討。