錢娟 黃銳 曹齊 張維 袁婧

進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病（progressive multifocal leukoencephalopathy，PML）是一種由JC病毒感染導(dǎo)致的亞急性脫髓鞘疾病，于1958年首次報告[1]。好發(fā)于免疫功能低下人群，如人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染、惡性腫瘤、器官移植、使用免疫抑制劑等患者，致死率高，隨著HIV全球流行，該病發(fā)病率逐漸升高[2]。PML起病隱匿，早期臨床表現(xiàn)缺乏特異性，傳統(tǒng)檢測方法陽性率較低，可能造成疾病延誤診治。鑒于此，本研究回顧性分析了2019年1月至2021年6月重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心經(jīng)過腦脊液宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）確診的11例HIV相關(guān)進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病患者臨床資料，探討mNGS在PML診斷中的應(yīng)用價值，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，旨在提高對該病認(rèn)識，為臨床診療提供幫助。

1 對象與方法

1.1 研究對象 研究對象為2019年1月至2021年6月重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心收治的HIV相關(guān)進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病住院患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均確診HIV感染；②接受腦脊液mNGS技術(shù)檢測；③診斷為PML。HIV診斷標(biāo)準(zhǔn)：HIV診斷符合《中國艾滋病診療指南》（2021版）[3]，HIV抗體篩查試驗陽性和抗體補充試驗陽性。PML診斷：根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、腦脊液常規(guī)、生化、典型頭顱MRI表現(xiàn)、mNGS技術(shù)檢測出腦脊液JC病毒基因序列。排除標(biāo)準(zhǔn)：感染HIV前已經(jīng)存在明確的神經(jīng)系統(tǒng)病變。本研究通過重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 行腰椎穿刺術(shù)留取無菌腦脊液適量，采集后一管立即封口至-20℃冰箱凍存，冷鏈運輸至廣州賽哲生物科技股份有限公司進(jìn)行高通量測序；其余送至我院檢驗科行常規(guī)和生化檢測。

1.2.2 JC病毒測序方法及數(shù)據(jù)分析 腦脊液標(biāo)本經(jīng)過離心富集得到的樣本富集液，使用微生物DNA提取試劑盒結(jié)合磁珠進(jìn)行核酸提取與純化，提取試劑盒采用MAGEN（中國廣州）試劑盒，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。提取好的核酸按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行宏基因組文庫的構(gòu)建，并以qPCR技術(shù)（Bio-Rad CFX96，USA）進(jìn)行精準(zhǔn)定量后，將加有不同index接頭序列的文庫等量混合，再運用Illumina Nextseq 550 DX測序平臺進(jìn)行高通量測序。測序數(shù)據(jù)經(jīng)FastQC軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)基本過濾后獲得為Cleanreads數(shù)據(jù)，再與人類基因組參考序列（版本：GRCh38）進(jìn)行對比，所用軟件為BWA（Burrows-Wheeler Aligner），去除人類序列后,與經(jīng)賽哲生物專屬的病原微生物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，獲得病原微生物的鑒定與定量結(jié)果。

1.2.3 資料收集 查閱住院電子病歷系統(tǒng)，并對所有患者進(jìn)行門診及電話隨訪。整理收集艾滋病合并PML患者的性別、年齡、HIV感染途徑、既往病史、合并感染情況、臨床表現(xiàn)、實驗室和影像學(xué)檢查、治療及預(yù)后等結(jié)果，總結(jié)其臨床特征，同時復(fù)習(xí)相關(guān)文獻(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共11例艾滋病合并PML患者符合入選標(biāo)準(zhǔn)，且患者均來自于重慶地區(qū)，編號1～11。其中男7例，女4例，年齡（45.9±10.9）歲。8例患者經(jīng)異性性傳播感染HIV，另外3例經(jīng)同性性傳播感染。CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)的中位值為52（20～146）個/μL。除2例患者（病例3和10）確診HIV感染數(shù)年一直未治療外，其余患者均因此次入院才發(fā)現(xiàn)HIV感染。11例患者中有1例（病例8）合并重癥肺孢子菌肺炎（pneumocystis pneumonia ,PCP），1例（病例2）合并口腔念珠菌感染及高血壓病史，其余無合并感染及基礎(chǔ)疾病。見表1。

表1 患者基線資料

2.2 臨床表現(xiàn) 11例HIV合并PML患者最常見的臨床癥狀為肢體乏力、認(rèn)知功能障礙和頭暈，分別占10/11、8/11和5/11；而惡心、視物模糊、精神異常較少出現(xiàn)，僅占2/11、1/11和1/11，見表2。

表2 11例艾滋病合并PML患者的臨床表現(xiàn)

2.3 頭顱磁共振表現(xiàn) 11例HIV感染合并PML患者頭顱磁共振均提示有廣泛病變，病變范圍包括腦干、雙側(cè)額葉、顳葉、枕葉、胼胝體、小腦半球、基底節(jié)區(qū)、半卵圓中心等，可見多發(fā)條片、斑片狀異常信號。見圖1。

圖1 HIV感染合并PML患者的頭顱MRI表現(xiàn) A，雙側(cè)額頂葉內(nèi)見多發(fā)斑片狀、片狀異常信號區(qū)，T2WI呈高信號影。B，左側(cè)小腦半球多發(fā)斑片狀異常信號，T2WI呈稍高信號。C，雙側(cè)半卵圓中心多發(fā)斑片狀長T2信號影，F(xiàn)LAIR序列呈高信號影。D，左側(cè)額頂葉、右側(cè)半卵圓中心見片狀及斑片狀長T2信號影。

2.4 腦脊液檢測結(jié)果 11例患者行腰椎穿刺術(shù)送檢腦脊液檢測, 2例患者測腦脊液壓力升高，其余9例均正常；4例患者腦脊液蛋白質(zhì)輕度增高，7例正常；2例腦脊液細(xì)胞數(shù)目輕度升高，9例正常；糖、氯化物均在正常范圍內(nèi)。見表3。

2.5 病原微生物基因檢測結(jié)果 11例HIV感染合并PML患者腦脊液送檢 mNGS，均檢測出JC病毒，其序列數(shù)為1～467條不等。見表3。

表3 腦脊液實驗室檢查結(jié)果

2.6 治療及預(yù)后 入院后患者均接受抗HIV病毒治療。病例8因合并重癥肺孢子菌肺炎，故經(jīng)抗PCP治療2周后啟動抗HIV治療，其余患者一經(jīng)確診便立即開始高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（highly active antiroviral therapy，HARRT）治療,7例患者使用拉米夫定/富馬酸替諾福韋/多替拉維鈉抗HIV，其余4例使用拉米夫定/富馬酸替諾福韋/依非韋倫抗HIV治療。同時給予營養(yǎng)支持、調(diào)節(jié)免疫力等治療，對于肢體功能障礙者進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練。至最后隨訪時間（2021年12月），11例患者中有6例存活，存活的患者中有3例（病例3、6、9）臨床癥狀較入院時好轉(zhuǎn)，3例（病例4、10、11）病情穩(wěn)定；2例患者失訪；3例死亡（病例1、5、7）。確診PML至死亡時間為4～13個月。見表1。

3 討論

JC病毒屬于多瘤病毒科（polyomaviridae）中的一種，其基因組是一條無包膜閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，基因全長為5130 kb[4]。JC病毒最早于1971年在1例 PML 患者大腦中首次分離出來［5］。90%以上的人群在兒童期發(fā)生初次感染，此時一般無癥狀或輕微的呼吸道癥狀，隨后病毒以潛伏狀態(tài)存在于人體。當(dāng)人體出現(xiàn)免疫抑制時，JC病毒發(fā)生激活并大量增殖，進(jìn)而引發(fā)PML，但其致病機(jī)制目前尚不清楚。有文獻(xiàn)［6］顯示JC病毒主要使大腦中少突膠質(zhì)細(xì)胞裂解破壞和進(jìn)行性脫髓鞘，表現(xiàn)為嚴(yán)重的多節(jié)段髓鞘病變，故大腦白質(zhì)中可分布多個病灶，包括腦干、基底神經(jīng)節(jié)、丘腦、腦半球和小腦等。隨著HIV流行，HIV患者PML發(fā)病率逐漸升高，PML在艾滋病中的發(fā)生率為1.0%～5.3%［7］。在HIV患者中，CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)＜200個/μL是PML的危險因素，但部分患者CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)亦可高于200個/μL。某些病例顯示PML可在HARRT治療后被發(fā)現(xiàn)，這可能與免疫重建或者HARRT治療失敗有關(guān)［8］。

PML病理組織學(xué)的主要特征是JC病毒感染的少突膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞核增大腫脹，其內(nèi)具有病毒顆粒的集合，在光鏡下可見包涵體和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的損失，最終導(dǎo)致細(xì)胞溶解，使得少突膠質(zhì)細(xì)胞所支持的髓鞘破壞。部分研究發(fā)現(xiàn)，相鄰皮質(zhì)中的神經(jīng)元也可能被病毒感染［8］，可能是因為脫髓鞘導(dǎo)致軸突功能障礙，脫髓鞘的軸突更加容易受神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放的細(xì)胞產(chǎn)物的傷害，軸突損傷又可導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞體的逆行損傷，神經(jīng)元的損傷可能是永久性的［7］。

PML通常起病隱匿，疾病早期癥狀通常不會引起患者的重視，大多數(shù)患者只有在認(rèn)知或運動功能明顯受損時才會就診。其臨床表現(xiàn)無特異性，與病變累及大腦的部位有關(guān)。大腦半球病變相關(guān)的臨床特征是最常見的癥狀，超過50%的患者出現(xiàn)運動功能障礙［9］。本組11例患者中，肢體乏力、認(rèn)知功能障礙、頭暈最多見，與文獻(xiàn)報道相符。本病呈亞急性起病，隨病灶的擴(kuò)大融合，患者的癥狀加劇并增多，后期神經(jīng)損害癥狀更加突出，可導(dǎo)致殘疾或死亡。

由于JC病毒主要感染少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致皮層下白質(zhì)廣泛性脫髓鞘，呈現(xiàn)在顱腦MRI可顯示出典型腦白質(zhì)病變，因本質(zhì)上是多灶性的，故大腦多個區(qū)域均可受累。典型PML病變呈雙側(cè)多發(fā)、非對稱性分布，少數(shù)病變?yōu)閱蝹?cè)發(fā)病，雙側(cè)大腦半球、頂葉最易受累，其次是額葉，額頂葉受累，胼胝體受累也常見，脊髓受累少見［9］。病變早期在T1加權(quán)像呈低信號，在T2加權(quán)像和FLAIR像上顯示出多個高信號強(qiáng)度病變，累及皮層下“U”形纖維呈“扇貝”形，由于很少或者沒有炎癥改變，通常增強(qiáng)掃描無占位效應(yīng)，文獻(xiàn)報告中有極少部分病變亦可累積大腦灰質(zhì)［10］。本組病例中額葉、顳葉、枕葉、胼胝體、小腦半球、半卵圓中心、右側(cè)丘腦、基底節(jié)區(qū)等部位均有病變，與文獻(xiàn)報告一致。

腦脊液（CSF）檢查對排除其他中樞性病變有較大幫助，細(xì)胞數(shù)目一般不超過20×106/L，部分病例腦脊液蛋白輕度升高，糖及氯化物基本正常。通過PCR技術(shù)檢測腦脊液中的JC病毒DNA具有重要的診斷價值，PCR的敏感性為72%～92%，特異性為92%～100%［11-13］。但陰性結(jié)果并不排除PML，有可能因腦脊液中病毒量較低造成假陰性。另外有研究表明在無PML的正常人腦脊液中可檢測到JC病毒，HAART治療或者CD4較高情況下，PCR檢測JC病毒的能力大大降低，可能會使實驗室診斷變得困難，這對于開始接受HAART治療但仍發(fā)展為PML患者進(jìn)一步診斷提出新的挑戰(zhàn)［11］。病變腦組織活檢特異性為100%，可為確診金標(biāo)準(zhǔn)，但此為有創(chuàng)性操作，臨床實施較為困難，患者接受度較低。且腦脊液mNGS技術(shù)近年來廣泛運用于各種病原菌檢測中，可快速對DNA或RNA的堿基序列進(jìn)行測序，對篩查中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染具有較高價值，可識別未知或罕見病原體，其快速、簡便、特異度及靈敏度均較高。本組病例除檢測出JC病毒外，均未檢出其他病毒，再結(jié)合患者免疫缺陷、臨床表現(xiàn)、MRI等典型表現(xiàn)，均可作出HIV相關(guān)性PML診斷。

當(dāng)前沒有針對PML的有效療法，預(yù)后差，其中位生存期為6個月，發(fā)病1年后不到10%存活率［14］。就艾滋病而言，HARRT治療是目前被證實的唯一有效治療方法［15］。國外也有嘗試于其他抗病毒藥或免疫調(diào)節(jié)劑的研究，但均以失敗告終。有研究或個案報告用阿糖胞苷經(jīng)靜脈或鞘內(nèi)給藥、多西福韋、托泊替康、干擾素-2β、米氮平對患者進(jìn)行治療，但均未能得到理想效果，相反，因其往往合并較多藥物毒副反應(yīng)，對患者總體預(yù)后無顯著改善［16-19］。總之，自采用高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（HAART）以來，艾滋病合并PML患者的中位生存時間增加了，但存活的患者往往合并神經(jīng)后遺癥。本組研究中所有患者確診PML后均給予HAART治療，至最后隨訪截止日期生存時間最長為14個月，但存活患者中50%臨床癥狀并未得到明顯改善。有研究提出采用五聯(lián)方案抗病毒治療，生存期可能得到改善，可能優(yōu)于傳統(tǒng)三聯(lián)HAART方案［20］，但目前尚無更多證據(jù)支持。

自1971年JC病毒被發(fā)現(xiàn)以來,其引起的HIV相關(guān)PML受到了廣泛關(guān)注，但對JC病毒的流行病學(xué)、發(fā)病機(jī)制、分子生物學(xué)以及PML的治療方法的研究還不夠深入。如今PML的發(fā)病率和死亡率逐年增高,而對JC病毒的快速檢出,無論是對實驗室進(jìn)行基礎(chǔ)研究還是臨床上實現(xiàn)早期診斷都有重要意義,所以建立靈敏度高、特異性好的檢測方法尤為重要，傳統(tǒng)PCR法檢測JC病毒存在局限性，而腦脊液mNGS能有效的檢測出JC病毒，具有一定優(yōu)勢。目前無針對PML治療的有效方法，預(yù)后差，有效的HARRT治療可能改善患者預(yù)后。