胡嵐嵐，張 樂，湯建林（陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院國家藥物臨床試驗機構，重慶 400037）

依匹斯?。╡pinastine，EPST）是一種具有非鎮(zhèn)靜作用的高選擇性H1受體拮抗劑。與第一代抗組胺藥物相比，鹽酸依匹斯汀難以透過血腦屏障，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用較弱[1-2]，具有臨床應用價值。臨床上多用其鹽酸鹽形式，主要用于抗過敏及哮喘的防治[3-6]。鹽酸依匹斯汀主要在肝臟內(nèi)代謝，但有報道[7]稱其代謝程度很低，大部分進入體內(nèi)的依匹斯汀以原型排出體外。目前國內(nèi)對鹽酸依匹斯汀的藥代動力學（pharmacokinetics，PK）研究報道較少，測定體內(nèi)依匹斯汀血藥濃度的方法主要是高效液相色譜-紫外檢測法（high performance liquid chromatographyultraviolet，HPLC-UV）[8-12]。近期有國外研究[13-15]分別采用兩種分析方法（HPLC-UV和 UPLC-MS/MS）對依匹斯汀的人體藥代動力學進行研究，指出兩種方法均能滿足依匹斯汀的血藥濃度測定，實驗室可以根據(jù)需求選擇合適的檢測方法。本文以鹽酸地芬尼多為內(nèi)標，采用液液萃取方法處理血漿，建立了HPLCUV分析方法測定人體中鹽酸依匹斯汀的血藥濃度，以期為臨床提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters-600E型高效液相色譜系統(tǒng)及Empower色譜管理軟件（美國Waters公司）；色譜柱：Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，迪馬公司）；MC-210S型電子天平（精度0.01 mg，德國Sartorius公司）；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；XH-86多用途旋渦混合器（江蘇阜寧縣羅橋校辦工廠）；Millipore超純水系統(tǒng)。

1.2 藥品與試劑

鹽酸依匹斯汀原料藥（含量99.3%，四川科瑞德制藥有限公司）；內(nèi)標鹽酸地芬尼多對照品（含量≥99.3%，中國藥品生物制品檢定所）；乙醚（AR級，洋州三和化工有限公司）；乙腈、甲醇（色譜純，霍尼韋爾Burdick & Jackson公司）；磷酸（分析純，重慶川東化學試劑廠）；磷酸二氫鈉（分析純，重慶北碚化學試劑廠）；氫氧化鈉（分析純，北京化工廠）；試驗用水均為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液配制

2.2.1 鹽酸依匹斯汀對照品溶液精密稱取鹽酸依匹斯汀對照品5 mg，用少量去離子水溶解后，再定容至50 mL，配成濃度為100 μg·mL-1的鹽酸依匹斯汀儲備液，取其儲備液用去離子水梯度稀釋至濃度分別為3.0、2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.2、0.1 μg·mL-1的標準工作液，冰箱（4 ℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 內(nèi)標對照品溶液精密稱取鹽酸地芬尼多對照品5 mg，用少量去離子水溶解后，再定容至50 mL，配成濃度為100 μg·mL-1的鹽酸地芬尼多儲備液，將鹽酸地芬尼多儲備液稀釋至濃度為10 μg·mL-1的工作液，冰箱（4 ℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 色譜條件

流動相：乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鈉（27∶73，pH = 4.5）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：210 nm；柱溫：30 ℃。

2.3 血漿樣品處理

精密移取空白血漿1000 μL，加入內(nèi)標工作液10 μL，混勻后加入1 mol·L-1的NaOH溶液1000 μL和乙醚5 mL，旋渦提取10 min后，于9000 r·min-1條件下離心10 min，準確吸取有機相于離心管中，室溫下氮氣吹干。殘渣加入流動相200 μL，旋渦振蕩10 min，離心后取上清液50 μL進樣。

2.4 給藥方案及安全性評價

男性受試者20例，年齡18 ～ 28歲，身高160 ～185 cm，BMI 19 ～ 24 kg·m-2，并經(jīng)血壓、心率、肝腎功能、血尿常規(guī)和心電圖檢查證實為健康受試者。合格受試者要求無中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、肝腎、消化道、肺及過敏性疾病病史，在試驗前1個月內(nèi)未服用其它藥物，試驗前3個月內(nèi)未參加已批準的藥物臨床試驗，試驗期間不飲用茶、酒和含咖啡因的飲料且禁止吸煙。受試者入組后根據(jù)臨床常規(guī)用量確定服藥劑量為含主藥鹽酸依匹斯汀40 mg，以溫開水200 mL送服。服藥前12 h禁食，于次日清晨空腹給藥，2 h后可飲水，3.5 h后統(tǒng)一用餐。分別于給藥前和給藥后0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、24、36 h抽取上肢靜脈血4 mL，肝素抗凝后分離血漿，于-20 ℃冰箱儲存待測。本研究方案經(jīng)由第三軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批同意（臨審第2007006號）。

受試者在試驗前簽署知情同意書，并在試驗期間統(tǒng)一進食，清淡飲食，研究醫(yī)生在給藥前后通過詢問和受試者主動報告的方式記錄不良反應，并于試驗結束后對受試者進行常規(guī)的體格檢查以及實驗室檢查。

2.5 方法的專屬性

在210 nm紫外檢測條件下，鹽酸依匹斯汀和內(nèi)標鹽酸地芬尼多均有較好的響應，本試驗考察了6個不同來源的健康人空白血漿，獲得空白血漿樣品圖譜；將含藥血漿按照“2.3”項下操作后進行分析，獲得標準含藥血漿圖譜及受試者口服藥物后的含藥血漿圖譜；比較空白血漿與含藥血漿圖譜，考察方法的專屬性，詳見圖1，顯示待測物鹽酸依匹斯汀與內(nèi)標物鹽酸地芬尼多峰形良好，且能夠與血漿中內(nèi)源性雜質分離完全，待測物和內(nèi)標的保留時間分別為7.4 min和12.3 min。

圖1 高效液相色圖譜A - 空白人血漿，B - 40 ng·mL-1鹽酸依匹斯汀血漿樣品，C - 服藥1.5 h后受試者血漿樣品；1 - 鹽酸依匹斯汀，2 - 內(nèi)標鹽酸地芬尼多Fig 1 HPLC chromatogramA - blank human plasma, B - blank plasma spiked with EPST at 40 ng·mL-1, C - plasma sample from volunteer 1.5 h after oral administration; 1 - epinastine hydrochloride, 2 - internal standard difenidol hydrochloride

2.6 校準曲線樣品制作

取已配制好的鹽酸依匹斯汀各濃度標準工作液50 μL，加入950 μL空白血漿，渦旋混勻30 s后按“2.3”項下操作，配制成鹽酸依匹斯汀血漿濃度為5、10、20、40、60、80、100、150 ng·mL-1的系列溶液，每個濃度平行2份。記錄圖譜，以待測物鹽酸依匹斯汀與內(nèi)標峰面積的比值（Y）對藥物濃度（X）作線性回歸分析，并用最小二乘法計算得到回歸方程：Y= 0.012 7X- 0.019 4，r= 0.998 9，線性范圍5 ～150 ng·mL-1。

2.7 回收率和精密度

配制低、中、高濃度分別為5、40、100 ng·mL-1的鹽酸依匹斯汀質控樣品，按“2.3”項下操作，測定峰面積，按回歸方程計算濃度，分別于同天不同時間段測定6次，以及每天測定6次連續(xù)測定3 d，考察日內(nèi)、日間精密度和方法回收率。結果見表1，結果顯示人血漿中鹽酸依匹斯汀的日內(nèi)精密度RSD ＜ 8.17%，日間精密度RSD ＜ 8.83%，方法回收率在101.4% ～106.2%，均符合試驗要求。

表1 鹽酸依匹斯汀精密度和回收率. n = 5Tab 1 Precision and recovery rate of epinastine hydrochloride. n = 5

2.8 樣本穩(wěn)定性

筆者分別考察了含藥血漿樣品在室溫放置24 h、待測物和內(nèi)標儲備液4 ℃冰箱放置40 d、-80 ℃冰箱凍存放置29 d、3次凍融循環(huán)條件下的穩(wěn)定性。

儲備液穩(wěn)定性考察是將待測物鹽酸依匹斯汀和內(nèi)標儲備液于0、1、2、3、5、7、14、21、40 d從冰箱取出后稀釋至0.8 μg·mL-1和1 μg·mL-1待測液測定其峰面積并觀察穩(wěn)定性。含藥血漿穩(wěn)定性考察是將待測物配制成低、中、高濃度的質控樣品（5、40、100 ng·mL-1），經(jīng)過不同條件和時間放置后按照“2.3”項下操作，進樣分析。穩(wěn)定性結果見表2，結果顯示待測物鹽酸依匹斯汀和內(nèi)標對照品在4 ℃冰箱至少可放置40 d（RSD ＜13.7%）；血漿樣品在室溫下至少可放置24 h（RSD ＜11.5%）；-80 ℃冰箱凍存至少可放置30 d（RSD ＜11.31%）；凍融循環(huán)三次后仍穩(wěn)定（RSD ＜ 8.35%）。

表2 鹽酸依匹斯汀穩(wěn)定性考察. n = 3Tab 2 Stability data of epinastine hydrochloride. n = 3

2.9 藥代動力學和安全性評價

20例男性成人健康受試者口服鹽酸依匹斯汀分散片40 mg后，采用HPLC-UV法測定人血漿中鹽酸依匹斯汀濃度，所得數(shù)據(jù)經(jīng)BECS軟件（上海宏能軟件有限公司）統(tǒng)計分析。人體內(nèi)平均血藥濃度-時間均數(shù)曲線見圖2，主要藥代動力學參數(shù)見表3。結果顯示，成年人口服鹽酸依匹斯汀約（2.18±1.05）h達血藥峰值濃度，血漿濃度消除半衰期為（8.77±4.19）h。整個試驗階段在醫(yī)護人員的監(jiān)控下進行，受試者在試驗期間無退出和脫落病例，依從性較好。未發(fā)生不良反應，說明本品在試驗劑量下安全性較好。

圖2 鹽酸依匹斯汀血藥濃度-時間曲線圖. n = 20Fig 2 Blood concentration-time profile of epinastine hydrochloride. n = 20

表3 口服鹽酸依匹斯汀分散片后主要藥代動力學參數(shù). n = 20Tab 3 Pharmacokinetic parameters of epinastine hydrochloride after oral administration. n = 20

3 討論

3.1 內(nèi)標物選擇

以往多數(shù)研究[7,9,10]選擇替硝唑為內(nèi)標，本試驗根據(jù)內(nèi)標物選擇原則，對多種標準品（含替硝唑）進行了篩選，最后發(fā)現(xiàn)鹽酸地芬尼多與待測物分離較好，且內(nèi)標物和待測物均不受血漿內(nèi)源性物質干擾，滿足紫外檢測的分離條件。

3.2 流動相的選擇

在液相色譜檢測時常用的有機流動相體系為甲醇和乙腈，而無機相的選擇往往是難點。因鹽酸依匹斯汀極性較強，在選擇無機相時，筆者首先考慮了去離子水，分別采用乙腈-水體系和甲醇-水體系進樣對照，結果顯示在乙腈-水體系下柱壓較小，而甲醇的柱壓較大，在峰型差異較小的情況下，本試驗選擇了柱壓較小的乙腈作為有機流動相。采用純水作為無機流動相時，峰拖尾嚴重，且待測物和內(nèi)標分離效果差，故采用磷酸緩沖液進行試驗，首先磷酸在低波長處無吸收，其次緩沖液可以控制流動相pH值，改善分離效果和峰形。考慮到色譜柱的耐酸范圍及鹽酸依匹斯汀的性質，分別考察了乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鈉體系在pH為3.5和4.5時分離的效果和峰型，結果顯示在pH = 4.5時，待測物和內(nèi)標的峰型較好，且不受空白血漿的干擾。

3.3 血漿樣品的處理

筆者曾嘗試用蛋白沉淀法處理血漿樣本，由于依匹斯汀在人體內(nèi)濃度較低，達到納克級，采用甲醇和乙醚作為蛋白沉淀劑時，待測物定量下限達不到要求。故考慮采用液液萃取的方法進行血漿處理，萃取劑選擇了二氯甲烷和乙醚兩種有機溶劑，結果發(fā)現(xiàn)，使用乙醚液液萃取再濃縮的方法，不僅能滿足定量下限的要求，也滿足回收率測定。

綜上，本文建立了HPLC-UV法測定人血漿中鹽酸依匹斯汀濃度，該方法準確、重現(xiàn)性好，適用于臨床和實驗室對鹽酸依匹斯汀的體內(nèi)血藥濃度檢測。本臨床試驗中，20例受試者口服鹽酸依匹斯汀分散片40 mg后，達峰濃度Cmax、達峰時間Tmax、半衰期t1/2分別為：（56.74±14.19）ng·mL-1、（2.18±1.05）h、（8.77±4.19）h，這些參數(shù)與其他文獻報道[1,10]（口服40 mg劑量鹽酸依匹斯?。┑臄?shù)據(jù)相似。且該藥在20例受試者體內(nèi)安全性和耐受性良好，無不良反應發(fā)生。