韓 雪，宋國(guó)新，王 敏，陳 剛，季 盼，張煒明

免疫組化雙重染色是指在同一張切片上同時(shí)顯示兩種不同的抗原，大多采用異種屬抗體間接標(biāo)記法，即兩種標(biāo)記的一抗分別來源于不同種屬。臨床實(shí)踐中使用的一抗種屬單克隆鼠來源較多，滿足免疫組化雙染可配伍組合抗體少，限制了免疫組化雙染技術(shù)的應(yīng)用。本科室通過實(shí)驗(yàn)摸索，對(duì)免疫組化雙染方法進(jìn)行改良，使得相同種屬來源的抗體也可進(jìn)行免疫組化雙染。本文以肺腺癌組織Ki-67+CK7免疫組化雙染為例，介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理學(xué)部經(jīng)10%中性福爾馬林固定的肺腺癌組織60例，每例組織連續(xù)切片3張，切片厚度3 μm，防脫載玻片撈片，分別用于CK7、Ki-67免疫組化單染和Ki-67+CK7免疫組化雙染。

1.2 試劑Ki-67(鼠單抗，MX006)、CK7(鼠單抗，OV-TL12/30)、HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG聚合物與DAB顯色試劑盒購自福州邁新公司；內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、SAP試劑盒(生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG工作液、堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液)、快紅顯色劑購自北京中杉金橋公司；2 mol/L H2SO4溶液為實(shí)驗(yàn)室自配。

1.3 方法第1組切片行CK7免疫組化單染，DAB顯色；第2組切片行Ki-67免疫組化單染，DAB顯色；第3組切片行Ki-67+CK7免疫組化雙染。免疫組化雙染步驟如下：(1)常規(guī)組織切片脫蠟水化；(2)檸檬酸抗原修復(fù)液(pH 6.0)高溫高壓熱修復(fù)12 min，自然冷卻；PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(3)滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(4)滴加一抗Ki-67(鼠單抗)，4 ℃孵育過夜或37 ℃孵育1 h，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(5)滴加HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG聚合物，室溫孵育20 min，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(6)滴加DAB顯色液，鏡下控制顯色3 min，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(7)滴加2 mol/L H2SO4溶液，室溫2 min，流水沖洗5 min，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(8)滴加一抗CK7(鼠單抗)，4 ℃孵育過夜或37 ℃孵育1 h，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(9)滴加生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG工作液，37 ℃孵育15 min，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(10)滴加堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育15 min，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(11)滴加快紅顯色液，室溫孵育10～15 min，鏡下控制顯色，自來水充分洗滌；(12)蘇木精復(fù)染，水溶性封片膠封固，鏡下觀察。

1.4 結(jié)果判讀由兩名高年資病理醫(yī)師對(duì)所有染色切片進(jìn)行雙盲判讀：CK7表達(dá)于正常腺上皮及肺腺癌上皮細(xì)胞，陽性定位于細(xì)胞質(zhì)；Ki-67主要表達(dá)于增殖期細(xì)胞，陽性定位于細(xì)胞核。免疫組化單染時(shí)CK7、Ki-67呈棕色，免疫組化雙染時(shí)CK7呈玫紅色、Ki-67呈棕色。

2 結(jié)果

第1組切片中CK7陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈棕色，染色背景干凈，細(xì)胞定位清晰(圖1)；第2組切片中Ki-67在腫瘤細(xì)胞及周圍炎癥細(xì)胞均有表達(dá)，陽性細(xì)胞胞核呈棕色，細(xì)胞定位清晰(圖2)；第3組切片中CK7陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈鮮艷玫紅色，Ki-67陽性細(xì)胞胞核呈棕色，Ki-67+CK7陽性共染腫瘤細(xì)胞鏡下清晰可見，同時(shí)可見腫瘤細(xì)胞周圍圍繞較多核陽性的非腫瘤細(xì)胞(圖3、4)。與免疫組化單染相比，免疫組化雙染組CK7、Ki-67表達(dá)定位及染色強(qiáng)度無差別，通過計(jì)數(shù)共染腫瘤細(xì)胞占比，使得腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)的判讀結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。

①②③④

3 討論

應(yīng)用組織切片進(jìn)行免疫組化雙染，可以克服同一病例切片間因不同時(shí)間或空間差異而引起的樣本誤差，提高診斷信息量，與免疫組化單染相比，免疫組化雙染在觀察組織中兩種標(biāo)記抗體的相互定位關(guān)系時(shí)具有無可比擬的優(yōu)越性。

Ki-67是評(píng)估腫瘤細(xì)胞增殖活性指標(biāo)，因腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞種類復(fù)雜，Ki-67實(shí)際計(jì)數(shù)時(shí)易受各類非腫瘤的陽性背景細(xì)胞干擾，導(dǎo)致不同觀察者間或同一觀察者不同觀察時(shí)間點(diǎn)的計(jì)數(shù)結(jié)果有一定差異，影響腫瘤預(yù)后的精準(zhǔn)分析。本文應(yīng)用的Ki-67+CK7免疫組化雙染，可在同一張組織切片上清晰標(biāo)記出Ki-67染色陽性的腫瘤細(xì)胞，方便觀察者對(duì)增殖的腫瘤細(xì)胞精準(zhǔn)計(jì)數(shù)，可提高Ki-67判讀結(jié)果的一致性。

常規(guī)免疫組化雙染關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于：(1)合理的染色抗體配伍組合，確保所選標(biāo)記抗體定位于不同細(xì)胞或同一細(xì)胞的不同部位，并用不同顏色的顯色試劑區(qū)分[1-2]，常規(guī)應(yīng)用的辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)分別與底物作用后可獲得較好的棕色與玫紅色著色對(duì)比；(2)避免兩種標(biāo)記抗體之間的交叉反應(yīng)，一般市售雙染試劑盒中的兩種抗體分別來自不同種屬，即一個(gè)兔來源和一個(gè)鼠來源的抗體，但實(shí)際工作中常用的一抗大都來自同一種屬，即鼠來源，可供配伍雙染的抗體組合少，限制了免疫組化雙染技術(shù)的應(yīng)用。

本文中Ki-67和CK7都是鼠來源抗體，本實(shí)驗(yàn)對(duì)常規(guī)免疫組化雙染方法作如下改良，使之可適用于兩種同一種屬來源抗體的免疫組化雙染：(1)應(yīng)用2 mol/L H2SO4滅活第1次染色后殘留酶及一抗的活性，充分洗滌后，可避免與第2個(gè)一抗間相互干擾，同時(shí)低濃度酸短時(shí)處理切片后并不會(huì)影響后續(xù)免疫組化染色，也不會(huì)影響第1次染色過程中的DAB著色[3]；(2)兩步法與三步法相結(jié)合，兩步法標(biāo)記第一個(gè)抗體顯色，再用三步法標(biāo)記第二個(gè)抗體，即第二個(gè)一抗孵育后，先與生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG結(jié)合，再用堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉卵白素示蹤后快紅顯色，較之堿性磷酸酶直接標(biāo)記的羊抗小鼠IgG聚合物二抗，大大提高了檢測(cè)的敏感性。

隨著克隆抗體制備與標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，免疫組化雙染技術(shù)日趨成熟。為保證免疫組化雙染效果，需加強(qiáng)從標(biāo)本送檢到組織處理各個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制。首先，組織的處理質(zhì)量可直接影響染色效果，擬行免疫組化雙染前應(yīng)由診斷醫(yī)師結(jié)合組織形態(tài)學(xué)，充分評(píng)估組織處理情況后合理選擇配伍抗體[4-7]。其次，所選擇的配伍抗體應(yīng)是特異性、敏感性高的抗體，即所選擇的抗體在單染時(shí)有較好的標(biāo)記效果。最后，免疫組化雙染步驟較多，操作者需要更加耐心和細(xì)心，嚴(yán)格按操作流程進(jìn)行，才能獲得優(yōu)良的免疫組化雙染切片。