尤 佳，孟冰瑤，梁梟婷，華婉瑜，方 春，陳 潔，周 良，周 蕊

黑色素瘤(melanoma)是來源于黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤，具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移性，是皮膚癌死亡的主要原因[1-2]。放療是一種重要的腫瘤治療方式，可通過高劑量的紅外能量誘導(dǎo)DNA損傷、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分解，促進(jìn)癌細(xì)胞死亡。然而，由于黑色素瘤本身有較強(qiáng)的抗輻射性，目前放療僅用于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和某些頭頸部黑色素瘤的輔助治療[3]。因此，明確黑色素瘤放療抵抗的機(jī)制，將為黑色素瘤的臨床治療提供有力的治療靶點(diǎn)和方案。

Sirtuin家族是一組高度保守的脫乙酰基酶，人類共有7個(gè)Sirtuin成員(SIRT1～SIRT7)，可與p53、FOXO、PGC-1a、Ku70等蛋白相互作用，調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)、代謝、衰老、凋亡等重要病理、生理過程，并參與DNA損傷和修復(fù)[4]。SIRT7可以通過將蛋白脫乙?；{(diào)節(jié)細(xì)胞和表觀遺傳穩(wěn)態(tài)，抑制細(xì)胞凋亡[5-8]。然而，SIRT7在調(diào)節(jié)黑色素瘤放療抵抗中的作用并不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過檢測黑色素瘤中SIRT7和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討其對放療抵抗的影響，為黑色素瘤治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與動(dòng)物來源人黑色素瘤A375細(xì)胞，購自廣州Cellcook生物公司。雄性裸鼠(BALB/C-nu/nu)，4～5周齡，體重10～15 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，用于構(gòu)建體外移植瘤動(dòng)物模型。

1.2 彗星電泳實(shí)驗(yàn)將0.8%瓊脂糖凝膠置于載玻片上形成下膠，置于4 ℃過夜；按照同樣的方法配制0.9%低熔點(diǎn)的瓊脂糖膠作為上膠；將消化下來的細(xì)胞與熔化后冷卻至37 ℃的上膠混合，將細(xì)胞懸液和凝膠混合液滴在下膠上，4 ℃靜置4 h；將鋪好凝膠的玻片在20 V、300 mA的條件下避光電泳30 min；電泳結(jié)束后將玻片浸泡在中和液中充分中和；加入含EB的碘化丙錠(propidium iodide, PI)染料染色10 min，在熒光顯微鏡下觀察拍照，并用Image J圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.3 RNA測序及分析將不同處理的黑色素瘤細(xì)胞樣本送至廣州瑞寶生物公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序。使用Tophat2將RNA-Seq數(shù)據(jù)比對到人類基因組上(http://ccb.jhu.edu/software/tophat)；將HTSeq(http://www-huber.embl.de/HTSeq)應(yīng)用于比對的數(shù)據(jù)集，明確具有顯著差異表達(dá)的基因。使用DAVID 6.8更新差異表達(dá)基因的GO分析和KEGG分析(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)。RNA序列數(shù)據(jù)已上傳GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)。

1.4 Western blot提取細(xì)胞總蛋白并用Bradford法檢測蛋白濃度；配制聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離蛋白質(zhì)；將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入3%BSA封閉液室溫封閉1.5 h；按照1 ∶5 000的比例加入TBST稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜；按1 ∶5 000的比例加入TBST稀釋的二抗，37 ℃孵育1.5 h；將PVDF膜條帶正面朝上，平鋪在X光片板上，用顯色液均勻覆蓋PVDF膜條帶后，放入顯影儀中進(jìn)行曝光，并拍照保留結(jié)果。

1.5 異體移植瘤模型建立取體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的小鼠，將各處理的黑色素瘤細(xì)胞皮下注入小鼠的左右背部；用游標(biāo)卡尺測量并記錄腫瘤體積，用公式計(jì)算腫瘤體積：V=ab2/2，其中a為腫瘤最長徑，b為垂直方向最大橫徑；當(dāng)腫瘤體積達(dá)到1 500 mm3時(shí)，頸椎脫臼法處死小鼠，并取出皮下瘤。

1.6 免疫組化取石蠟切片，置于60～65 ℃恒溫烤箱中30 min烤片；將石蠟組織切片置于二甲苯(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)各10 min，再依次經(jīng)100%、95%、80%、75%乙醇各3 min，使切片脫蠟至水；在高壓鍋內(nèi)加入PBS(pH 6.0)，煮沸后加熱3 min對抗原進(jìn)行高壓熱修復(fù)；切片用3%H2O2避光處理15 min后，在玻片上滴加一抗，4 ℃過夜；滴加鼠或兔二抗，室溫孵育40～60 min；每張切片滴加100 μL顯色液，室溫孵育3～5 min，鏡下觀察到明顯棕黃色時(shí)用PBS終止反應(yīng)；將切片進(jìn)行HE染色，按照蘇木精3 min，流水沖洗5 mim，鹽酸乙醇分化3 s，流水沖洗20 min，梯度乙醇脫水至二甲苯各5 min，切片晾干后封固。免疫組化結(jié)果判讀：按照染色深淺，將腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度分為四級，分別是陰性(-)、弱陽性(+)、中等陽性()和強(qiáng)陽性()，以中陽性和強(qiáng)陽性為過表達(dá)或高表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0或Office Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪制圖表。對獨(dú)立樣本的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，采用非配對t檢驗(yàn)或單因素方差分析檢驗(yàn)；所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙尾檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIRT抑制劑對黑色素瘤細(xì)胞電離輻射(ionizing radiation, IR)敏感性的影響彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：黑色素瘤A357細(xì)胞的DNA損傷對IR呈現(xiàn)出劑量依賴性。隨著輻射強(qiáng)度的增強(qiáng)，慧尾DNA占比增加(P<0.001)，提示隨輻劑量增加，細(xì)胞DNA損傷越嚴(yán)重(圖1A)；由于8.0 Gy IR對黑色素瘤細(xì)胞DNA損傷最明顯，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用8.0 Gy為IR處理劑量。SIRT抑制劑處理下，黑色素瘤細(xì)胞對IR的敏感性增加，表現(xiàn)為彗尾DNA占比顯著增加(P<0.001，圖1B)。

圖1 彗星電泳實(shí)驗(yàn)檢測黑色素瘤細(xì)胞DNA損傷：A.彗星電泳分析IR對黑色素瘤細(xì)胞DNA損傷的劑量效應(yīng)，柱狀圖顯示黑色素瘤細(xì)胞DNA損傷的定量分析；B.彗星電泳分析SIRT抑制劑對黑色素瘤細(xì)胞IR敏感性的影響，柱狀圖顯示黑色素瘤細(xì)胞DNA損傷的定量分析；**P<0.01,***P<0.001

2.2 干擾SIRT7對黑色素瘤細(xì)胞IR敏感性的影響qRT-PCR和Western bolt結(jié)果顯示：與對照組(siNC)相比，siRNA干擾片段siSIRT7_01(AGCCATTTGTCCTTGAGGAA)和siSIRT7_02(GAACGGAACTCGGGTTATT)轉(zhuǎn)染人黑色素瘤細(xì)胞A375后，在IR處理和非處理(MOCK)條件下，SIRT7蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯減低(P<0.001，圖2A、B)。彗星實(shí)驗(yàn)檢測顯示：隨著輻射強(qiáng)度的增加，彗尾DNA占比增加(P<0.001)，提示細(xì)胞的DNA斷裂點(diǎn)增多，損傷越嚴(yán)重(圖2C)。

2.3 干擾SIRT7后轉(zhuǎn)錄組測序分析對干擾SIRT7后顯著上調(diào)的基因進(jìn)行GO富集分析后發(fā)現(xiàn)，被富集的GO中排名最靠前的包括：ATF6介導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶復(fù)合物、錯(cuò)誤折疊蛋白結(jié)合、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、PERK介導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)、Atg8連接酶活性和巨自噬等(P<0.05，表1)。京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路分析表明，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工和自噬調(diào)節(jié)在內(nèi)的分子途徑受到顯著影響(P<0.05，表1)。

圖2 干擾SIRT7對黑色素瘤IR敏感性的影響：A.qRT-PCR檢測SIRT7干擾片段效率，**P<0.01，***P<0.001；B.Western blot檢測SIRT7干擾片段效率；C.彗星電泳分析干擾SIRT7對黑色素瘤細(xì)胞IR敏感性的影響，柱狀圖顯示黑色素瘤細(xì)胞DNA損傷的定量分析

表1 干擾SIRT7后RNAseq結(jié)果的GO和KEGG通路分析

2.4 干擾SIRT7后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)在IR處理和非處理(MOCK)條件下，分別使用兩個(gè)干擾片段干擾SIRT7，用Western blot法檢測了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示：干擾SIRT7后，與siNC相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白XBP1和GRP78，自噬相關(guān)基因ATG3、ATG12及自噬標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ/LC3Ⅰ均顯著上調(diào)(圖3)。

圖3 干擾SIRT7對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 自噬抑制劑對SIRT7介導(dǎo)的黑色素瘤細(xì)胞自噬性死亡的影響采用Sytox Green染色黑色素瘤細(xì)胞，以識(shí)別和計(jì)算死亡細(xì)胞。在非IR治療條件下，干擾SIRT7增加了死亡細(xì)胞數(shù)量，而自噬抑制劑3-MA的治療降低了細(xì)胞凋亡率(P<0.05，圖4)。IR治療顯著提高了黑色素瘤細(xì)胞的凋亡率，而干擾SIRT7則顯著增強(qiáng)這一趨勢。然而，3-MA可以在較大程度上緩解干擾SIRT7誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(P<0.05，圖4)。因此，SIRT7缺失促進(jìn)了黑色素瘤細(xì)胞的自噬性細(xì)胞死亡。

2.6 SIRT7與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的相關(guān)性免疫組化和Western blot結(jié)果顯示：與siNC相比，干擾SIRT7后，MOCK組和IR處理組移植瘤中SIRT7表達(dá)降低。免疫組化染色顯示：分別在MOCK和IR處理下敲除SIRT7，與siNC組相比，siSIRT7組XBP1、GRP78、ATG3、ATG12和LC3B表達(dá)均顯著上調(diào)(圖5A)。其中，siNC組SIRT7為()，XBP1、GRP78、ATG3、ATG12和LC3B均(-)；siSIRT7組SIRT7為(+)或()，XBP1、GRP78、ATG3、ATG12和LC3B為()。Western blot結(jié)果也證實(shí)：干擾SIRT7后，XBP1、ATG12和LC3B表達(dá)顯著上調(diào)(圖5B)。以上結(jié)果提示，SIRT7可能通過負(fù)性調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬基因相關(guān)基因的表達(dá)，保護(hù)黑色素瘤細(xì)胞，降低其放療敏感性。

3 討論

放療是腫瘤重要的臨床治療方法，但黑色素瘤富含防輻射物質(zhì)黑色素，是放療抵抗較嚴(yán)重的人類腫瘤之一[9]。氧化應(yīng)激、DNA復(fù)制、IR、紫外線輻射以及各種基因和毒素等內(nèi)外壓力，可增加人體細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定以及DNA損傷，最終導(dǎo)致衰老和腫瘤[10]。Sirtuins在調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)等多種生物過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。本組著重分析了Sirtuin家族成員SIRT7，明確其在黑色素瘤中的生物學(xué)功能和黑色素瘤細(xì)胞放療抵抗中的作用與機(jī)制。SIRT7不僅參與基因組穩(wěn)定性，DNA修復(fù)和線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，還能調(diào)節(jié)癌基因表達(dá)和核糖體發(fā)生等[12]。SIRT7能直接與DNA損傷位點(diǎn)結(jié)合，并招募下游因子DNA損傷進(jìn)行修復(fù)，以維持基因組穩(wěn)定性，是復(fù)雜的DNA損傷反應(yīng)系統(tǒng)的重要組成部分[13]。SIRT7還在胃癌和乳腺癌等多種腫瘤中高表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞存活并抑制細(xì)胞凋亡的作用[6,14]。然而，自噬介導(dǎo)的SIRT7對腫瘤細(xì)胞的調(diào)控作用較少被探討。在前列腺癌中，SIRT7通過促進(jìn)雄激素受體信號(hào)通路增強(qiáng)雄激素誘導(dǎo)的自噬[15]。在膠質(zhì)瘤中，長鏈非編碼RNA MEG3通過調(diào)控SIRT7和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)自噬[16]。盡管已有上述研究，但SIRT7在黑色素瘤中的作用尚不清晰。

本組證實(shí)SIRT7缺失導(dǎo)致DNA損傷增加。SIRT7可直接參與DNA損傷修復(fù)，而其在癌基因表達(dá)、線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)、核糖體生物發(fā)生和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中也發(fā)揮重要作用[17-18]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一個(gè)巨大的膜網(wǎng)絡(luò)，是膜蛋白和分泌蛋白重要的組裝車間[19]。缺氧、氧化損傷、葡萄糖剝奪和輻射等內(nèi)外刺激不僅損害內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)折疊能力，還可以誘導(dǎo)以EIF2α磷酸化為特征的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和接下來的未折疊蛋白反應(yīng)[20]。未折疊蛋白反應(yīng)信號(hào)能夠上調(diào)伴侶基因表達(dá)，并誘導(dǎo)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)擔(dān)。然而，如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度超過“從生存到死亡”的閾值，就會(huì)通過誘導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來激活各種形式的細(xì)胞死亡[21]。自噬導(dǎo)致的細(xì)胞死亡稱為自噬性細(xì)胞死亡，其主要特征是細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量的自噬體和自噬溶酶體，最終細(xì)胞被自身的溶酶體消化降解[22]。

圖4 自噬抑制劑3-MA對SIRT7介導(dǎo)的細(xì)胞死亡的影響：A.Sytox Green染色顯示死亡細(xì)胞；B.柱狀圖顯示凋亡細(xì)胞數(shù)，*P<0.05

AMOCKIRsiNCsiSIRT7siNCsiSIRT7SIRT7GRP78XBP1ATG3ATG12LC3BB

圖5 在體內(nèi)干擾SIRT7對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬的影響：A.免疫組化染色檢測異種移植瘤中SIRT7以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)；B.Western blot檢測干擾SIRT7后，SIRT7以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

SIRT7與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間的關(guān)系鮮有報(bào)道。在慢性肝病中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以誘導(dǎo)SIRT7表達(dá)，并與Myc相互作用富集在核糖體基因的啟動(dòng)子處，通過沉默其表達(dá)緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[23]。此時(shí)，SIRT7表達(dá)是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的。本組發(fā)現(xiàn)SIRT7缺失可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的典型標(biāo)志物XBP1和GRP78的表達(dá)，它們作為伴侶來糾正蛋白質(zhì)折疊，為支持SIRT7作為黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的守護(hù)者提供新的證據(jù)。SIRT7敲低后轉(zhuǎn)錄組測序生物信息學(xué)分析提示，SIRT7在調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的自噬中發(fā)揮作用。本組通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)自噬基因ATG3和ATG12受SIRT7調(diào)控。ATG3作為E2樣結(jié)合酶介導(dǎo)LC3脂質(zhì)化，而ATG12是E3連接酶復(fù)合物之一，促進(jìn)基礎(chǔ)性自噬。此外，ATG3還可以與ATG12結(jié)合，形成復(fù)合物，連接晚期內(nèi)溶酶體運(yùn)輸[24]。SIRT7缺失可激活的自噬增加錯(cuò)誤折疊蛋白結(jié)合細(xì)胞死亡，屬于自噬性細(xì)胞死亡。

綜上，SIRT7可以負(fù)性調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，以增強(qiáng)黑色素瘤細(xì)胞的生存能力。本實(shí)驗(yàn)顯示SIRT7在維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)有望成為放療或其他應(yīng)激誘導(dǎo)療法中黑色素瘤治療的新靶點(diǎn)。