吉莉莉，張邢松，何 松，繆小兵

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是淋巴瘤中最常見的亞型，約占非霍奇金淋巴瘤的40%[1]。目前，R-CHOP(利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松)是DLBCL的一線治療方案，但仍有相當(dāng)一部分患者緩解后復(fù)發(fā)或原發(fā)耐藥[2]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)家族由STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B以及STAT6共7個成員組成。STAT5A表達異常已被證實與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本組前期實驗發(fā)現(xiàn)，STAT5核表達及pSTAT5AY694表達與DLBCL的治療反應(yīng)相關(guān)；STAT5核陽性、pSTAT5AY694陽性患者比陰性患者的總生存期縮短[3]，但STAT5A在DLBCL中的作用機制仍不清楚。本實驗旨在探討STAT5A在DLBCL耐藥中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株人DLBCL細(xì)胞OCI-Ly8由復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院周曉燕教授惠贈，OCI-Ly10細(xì)胞購自南京科佰生物公司。OCI-Ly8、OCI-Ly10細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10%、20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中。

1.2 主要試劑STAT5A抗體(稀釋比1 ∶500)購自武漢Proteintech公司(貨號13179-1-AP)，GAPDH抗體(稀釋比1 ∶5 000)購自武漢Proteintech公司(貨號HRP-60004)，Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)抗體(稀釋比1 ∶10 000)購自美國Jackson ImmunoResearch Laboratories公司(貨號111-035-003)，CCK-8檢測試劑盒購自上海東仁公司，多柔比星(Doxo)購自美國Sigma-Aldrich公司，臺盼藍拒染試劑盒購自上海碧云天公司，凋亡抗體芯片(proteome profiler human apoptosis array kit, ARY009)購自美國R&D Systems公司。

1.3 慢病毒感染及篩選STAT5A過表達/干擾慢病毒以及對照慢病毒購自上海吉凱基因公司。慢病毒感染按試劑盒說明書進行。感染完成后，以2 μg/mL的嘌呤霉素對細(xì)胞進行篩選，從而獲得STAT5A穩(wěn)定過表達(STAT5AOE)、穩(wěn)定敲低(shSTAT5A)或?qū)φ占?xì)胞(Ctrl/shCtrl)。

1.4 Western blot法收集STAT5AOE、shSTAT5A或?qū)φ占?xì)胞裂解后行SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)印后用含5%脫脂奶粉的PBST封閉2 h，加入STAT5A一抗4 ℃孵育過夜，PBST洗滌3次后使用Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)二抗室溫孵育2 h，PBST洗滌3次后ECL液顯影。

1.5 CCK-8細(xì)胞活性檢測將STAT5AOE及對照細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(每孔100 μL)，每組設(shè)置5個復(fù)孔，并設(shè)Blank對照(只加培養(yǎng)基不接種細(xì)胞)，使用不同濃度Doxo(0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L)刺激細(xì)胞，刺激完成后每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，取出培養(yǎng)板，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值。

1.6 臺盼藍拒染實驗將STAT5AOE、shSTAT5A或?qū)φ占?xì)胞使用1.0 μmol/L Doxo刺激72 h，刺激完成后收集細(xì)胞，PBS洗滌并重懸于PBS中；將10 μL細(xì)胞懸液與10 μL 0.4%臺盼藍溶液混合，室溫孵育1 min。使用血球計數(shù)板計數(shù)活細(xì)胞以及死亡細(xì)胞數(shù)目，細(xì)胞死亡比例(%)=死亡細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死亡細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.7 凋亡抗體芯片分析依據(jù)R&D Systems公司Proteome profiler human apoptosis array kit(ARY009)操作說明書完成抗體芯片檢測。

2 結(jié)果

2.1 過表達STAT5A對OCI-Ly8及OCI-Ly10細(xì)胞Doxo敏感性的影響Western blot實驗結(jié)果顯示：與對照組(Ctrl)相比，STAT5A蛋白表達水平在STAT5AOE組中顯著上調(diào)(圖1)。CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)：在OCI-Ly8細(xì)胞中STAT5AOE組與Ctrl組IC50相比：1.334 μmol/L(95%CI=1.205～1.476)vs0.714 5 μmol/L(95%CI=0.625 8～0.815 8)(圖2A)；在OCI-Ly10細(xì)胞中STAT5AOE組與Ctrl組IC50相比：1.232 μmol/L(95%CI=1.027～1.478)vs0.780 7 μmol/L(95%CI=0.701 4～0.869 0)(圖2B)；提示過表達STAT5A可降低OCI-Ly8及OCI-Ly10細(xì)胞對Doxo的敏感性。臺盼藍拒染實驗顯示：在OCI-Ly8細(xì)胞中Ctrl組與STAT5AOE組細(xì)胞死亡比例：(13.0±1.4)%vs(7.9±1.8)%(t=3.89，P=0.018)，Ctrl+Doxo組與STAT5AOE+Doxo組細(xì)胞死亡比例：(58.9±1.4)%vs(44.4±5.5)%(t=4.46，P=0.011，圖3A)，提示在OCI-Ly8細(xì)胞中過表達STAT5A可降低Doxo刺激/未刺激狀態(tài)下的細(xì)胞死亡；與之相似，在OCI-Ly10細(xì)胞中Ctrl組與STAT5AOE組細(xì)胞死亡比例：(15.7±2.8)%vs(9.7±2.6)%(t=2.94，P=0.042)，Ctrl+Doxo組與STAT5AOE+Doxo組細(xì)胞死亡比例：(53.9±3.5)%vs(34.8±4.6)%(t=5.80，P=0.004，圖3B)，提示在OCI-Ly10細(xì)胞中過表達STAT5A可降低Doxo刺激/未刺激狀態(tài)下的細(xì)胞死亡。上述研究表明，過表達STAT5A可抑制Doxo誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，介導(dǎo)細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生。

圖1 Western blot法檢測Ctrl以及STAT5AOE細(xì)胞中STAT5A蛋白表達水平：A.OCI-Ly8細(xì)胞；B.OCI-Ly10細(xì)胞

圖2 CCK-8法檢測Ctrl以及STAT5AOE細(xì)胞對多柔比星的敏感性：A.OCI-Ly8細(xì)胞；B.OCI-Ly10細(xì)胞

圖3 臺盼藍拒染法檢測過表達STAT5A后彌漫大B細(xì)胞瘤細(xì)胞對Doxo敏感性的影響：A.OCI-Ly8細(xì)胞；B.OCI-Ly10細(xì)胞；Untreated.未使用多柔比星刺激；Doxo. 1.0 μmol/L多柔比星刺激；*P<0.05，**P<0.01

2.2 敲低STAT5A后OCI-Ly8、OCI-Ly10細(xì)胞對Doxo敏感性的影響Western blot證實：與對照組(shCtrl)相比，STAT5A蛋白表達水平在shSTAT5A組中顯著下調(diào)(圖4)。臺盼藍拒染實驗顯示：在OCI-Ly8細(xì)胞中shCtrl組與shSTAT5A組細(xì)胞死亡比例：(12.4±2.0)%vs(17.9±2.6)%(t=2.90，P=0.044)，shCtrl+Doxo組與shSTAT5A+Doxo組細(xì)胞死亡比例：(51.8±6.1)%vs(67.7±6.5)%(t=3.10，P=0.036，圖5A)；與之相似，在OCI-Ly10細(xì)胞中shCtrl組與shSTAT5A組細(xì)胞死亡比例：(12.1±1.7)%vs(20.0±4.6)%(t=2.82，P=0.048)，shCtrl+Doxo組與shSTAT5A+Doxo組細(xì)胞死亡比例：(53.7±6.2)%vs(68.1±3.2)%(t=3.56，P=0.024，圖5B)，提示在OCI-Ly10細(xì)胞中敲低STAT5A同樣可增加Doxo刺激/未刺激狀態(tài)下的細(xì)胞死亡。上述研究表明，敲低STAT5A可促進Doxo誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，增強Doxo的敏感性。

圖4 Western blot法檢測shCtrl以及shSTAT5A細(xì)胞中STAT5A蛋白表達水平：A.OCI-Ly8細(xì)胞；B.OCI-Ly10細(xì)胞

圖5 臺盼藍拒染法檢測敲低STAT5A后彌漫大B細(xì)胞瘤細(xì)胞對Doxo敏感性的影響：A.OCI-Ly8細(xì)胞；B.OCI-Ly10細(xì)胞；shCtrl.對照細(xì)胞；shSTAT5A.STAT5A穩(wěn)定敲低細(xì)胞；Untreated.未使用多柔比星刺激；Doxo.1.0 μmol/L多柔比星刺激；*P<0.05

2.3 STAT5AOE對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響凋亡抗體芯片分析發(fā)現(xiàn)：在OCI-Ly8以及OCI-Ly10細(xì)胞中，p53(pS46)[磷酸化p53(Ser46)]、p53(pS392)[磷酸化p53(Ser392)]的表達在STAT5AOE組以及Ctrl組之間差異最明顯：STAT5AOE組p53(pS46)、p53(pS392)表達水平比Ctrl組降低(圖6)。上述研究提示，在OCI-Ly8以及OCI-Ly10細(xì)胞中STAT5AOE可能通過降低p53(pS46)以及p53(pS392)的表達水平抑制細(xì)胞凋亡。

圖6 凋亡抗體芯片分析Ctrl以及STAT5AOE細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達水平：A.OCI-Ly8細(xì)胞；B.OCI-Ly10細(xì)胞；抗體芯片陣列D9、D10代表Phospho-p53(S46)[p53(pS46)]，D11、D12代表Phospho-p53(S392)[p53(pS392)]

3 討論

DLBCL是一類高度異質(zhì)性疾病，在生物學(xué)行為、組織病理學(xué)以及臨床特征等多方面存在明顯差異。近20年來，R-CHOP是多數(shù)未經(jīng)治療DLBCL患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，但仍有高達40%患者出現(xiàn)難治或完全緩解后復(fù)發(fā)，這部分患者預(yù)后較差。DLBCL耐藥的形成包括遺傳和(或)表觀遺傳修飾，浸潤性免疫細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞改變腫瘤免疫環(huán)境提供凋亡保護等[4]。JAK-STAT信號通路主要由酪氨酸激酶相關(guān)受體、Janus激酶(Janus kinase, JAK)和STAT三個部分組成，參與免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖、分化等過程。未被激活的STAT以失活狀態(tài)存在于胞質(zhì)中。STAT的激活通常由細(xì)胞表面受體上的配體結(jié)合啟動，隨后保守的酪氨酸殘基發(fā)生激酶依賴性磷酸化，STAT隨后以二聚體和(或)四聚體的形式快速轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，并調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄[5-6]。STAT5A和STAT5B是STAT5高度同源的兩個亞型。STAT5含N端結(jié)構(gòu)域、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Src同源2結(jié)構(gòu)域以及C端反式激活結(jié)構(gòu)域等功能域。現(xiàn)已證實，STAT5異常活化與乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[7-8]。有研究表明，STAT5組成性激活在多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病中起重要作用，如外周T細(xì)胞淋巴瘤[9]、BCR-ABL陽性慢性粒細(xì)胞白血病[10]。本組前期研究顯示：STAT5核表達以及pSTAT5AY694表達與DLBCL患者的治療反應(yīng)有關(guān)，其在疾病進展/疾病穩(wěn)定患者中的表達高于部分緩解/完全緩解患者，且STAT5核陽性、pSTAT5AY694陽性DLBCL患者比陰性患者的總生存期縮短[3]，但STAT5A在DLBCL中的具體作用機制尚不清楚。有文獻報道，STAT5A在Doxo耐藥細(xì)胞系和化療耐藥患者中的表達水平較高，STAT5A通過調(diào)節(jié)ABCB1的轉(zhuǎn)錄促進乳腺癌細(xì)胞對Doxo的耐藥性；而利用STAT5抑制劑pimozide抑制STAT5A-ABCB1信號通路，可增強耐藥乳腺癌細(xì)胞對Doxo的敏感性[11]。Kosova等[12]報道，敲低STAT5A表達可增強伊馬替尼敏感和耐藥慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞對伊馬替尼的敏感性。本實驗發(fā)現(xiàn)，在OCI-Ly8和OCI-Ly10細(xì)胞中STAT5AOE可降低Doxo刺激/未刺激狀態(tài)下的細(xì)胞死亡；而shSTAT5A可增加Doxo刺激/未刺激狀態(tài)下的細(xì)胞死亡，提示過表達STAT5A可抑制Doxo誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，介導(dǎo)耐藥性的產(chǎn)生。

p53是多種應(yīng)激狀態(tài)下調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子。p53可通過兩種機制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：(1)p53可作為轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)促凋亡靶基因表達，并抑制抗凋亡靶基因表達；(2)p53轉(zhuǎn)移到線粒體可與BCL-2家族成員相互作用，誘導(dǎo)膜通透性和細(xì)胞色素C釋放[13]。p53的磷酸化修飾可以發(fā)生在p53的多個氨基酸殘基上，p53包含38個絲氨酸殘基和22個蘇氨酸殘基。文獻報道p53的46位絲氨酸發(fā)生磷酸化后獲得轉(zhuǎn)錄活性，可通過靶向調(diào)控p53調(diào)節(jié)凋亡誘導(dǎo)蛋白1(p53 regulated apoptosis inducing protein 1, p53AIP1)促進細(xì)胞色素C的釋放，繼而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。Castrogiovanni等[13]報道，p53的392位絲氨酸磷酸化可調(diào)節(jié)p53線粒體易位和轉(zhuǎn)錄非依賴性凋亡。本組通過凋亡抗體芯片分析發(fā)現(xiàn)，在OCI-Ly8和OCI-Ly10細(xì)胞中p53(pS46)、p53(pS392)的表達在STAT5AOE組以及Ctrl組之間差異最明顯：STAT5AOE組p53(pS46)以及p53(pS392)表達水平比Ctrl組降低；提示在OCI-Ly8和OCI-Ly10細(xì)胞中STAT5AOE可能通過降低p53(pS46)和p53(pS392)的表達抑制細(xì)胞凋亡，繼而誘導(dǎo)耐藥性的產(chǎn)生。

綜上所述，STAT5A高表達可降低DLBCL細(xì)胞對Doxo的敏感性，STAT5A可能通過降低p53(pS46)以及p53(pS392)的表達水平抑制細(xì)胞凋亡，繼而誘導(dǎo)耐藥性的產(chǎn)生。上述結(jié)論是否成立，還需體內(nèi)實驗進一步驗證。