張海霞，張 覓，騰曉燕，劉冰雪，肖園園，黃 菁

南京中醫(yī)藥大學附屬南京醫(yī)院（南京市第二醫(yī)院）檢驗檢測中心，江蘇 南京 210003

結核病是由結核分枝桿菌引起的慢性傳染病，由于耐藥菌株的產(chǎn)生和社會流動人口的增多等生物學和社會學因素，結核病已經(jīng)成為嚴重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題。據(jù)WHO 報道，目前我國仍為結核病高負擔國家之一，2017 年估算發(fā)病91 萬（全球總發(fā)患者數(shù)排第2 位的國家），實際登記發(fā)病77.8萬，約13.2萬患者被遺漏，而我國登記的結核患者中有病原依據(jù)的僅為31%［1］。因此如何快速而準確地為臨床提供病原學依據(jù)是結核患者發(fā)現(xiàn)、診斷的最重要步驟之一，是結核病防治的重要前提［2］。目前，結核病的病原學診斷主要依靠分枝桿菌的涂片法、培養(yǎng)和藥敏試驗等傳統(tǒng)的實驗室檢查技術。涂片法靈敏度低、培養(yǎng)法耗時長，且不能區(qū)分結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌，不能滿足臨床診療的需求，迫切需要引進新技術優(yōu)化結核病的診斷。2018年5月開始實行的肺結核診斷指南中將結核分枝桿菌的分子生物學陽性作為結核病確診依據(jù)［3］。GeneXpert 系統(tǒng)使用實時定量PCR 原理，整合并自動進行樣品純化、核酸擴增、單一或復雜樣品中的目標序列測定。GeneXpert系統(tǒng)使用一次性的Xpert檢測匣，檢測匣內(nèi)裝有PCR 反應試劑，可獨立進行PCR處理。該試劑盒采用自成一體的封閉設計，使得樣品之間的交叉污染減小到最低。GeneXpert 技術已在多個國家和地區(qū)應用，并被世界衛(wèi)生組織推薦為結核分枝桿菌和利福平耐藥性的檢測方法［4-5］。本研究利用GeneXpert 法對766 份不同類型的臨床樣本進行了檢測，并用傳統(tǒng)的直接涂片抗酸染色鏡檢法進行同步檢測，比較兩者對不同標本類型檢測陽性率的差異性，其中460 份標本同時進行了結核分枝桿菌培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)GeneXpert 的陽性率明顯高于其他方法。

1 材料和方法

1.1 材料

標本來自2018 年2—7 月于南京市第二醫(yī)院就診的結核及疑似結核患者766 例，男517 例，女249例，年齡7～92 歲。其中痰標本473 例，灌洗液185例，胸腹水61例，其他標本包括尿液、腦脊液、大便、膿液等47 例。分別對這些標本進行直接涂片抗酸染色鏡檢法檢測和GeneXpert檢測，其中有460例標本同步進行960 分枝桿菌快速培養(yǎng)，有106 例培養(yǎng)陽性的樣本進行了初步菌種鑒定。

GeneXpert 檢測儀器及配套試劑（Cepheid 公司，美國），BACTECTMMGITTM960 分枝桿菌培養(yǎng)檢測系統(tǒng)及配套試劑（BD公司，美國），分枝桿菌藥敏羅氏培養(yǎng)基、抗酸染色液（珠海貝索生物技術有限公司），Olympus CX23顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 直接涂片抗酸染色鏡檢法

取標本于玻片正面均勻涂抹成10 mm×20 mm的卵圓形薄膜，自然干燥后，置于染色架上，玻片間距保持10 mm 以上；加熱固定（5 s 內(nèi)將玻片來回過火焰4 次）；滴加石碳酸復紅溶液蓋滿玻片，加熱至出現(xiàn)蒸汽后，停止加熱，保持染色5 min，加熱時勿使染色液沸騰。流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去染液，瀝干；滴加酸性酒精溶液蓋滿玻片，脫色1～2 min；如有必要，需流水沖去酸性酒精溶液后，再次脫色至無可視紅色為止；流水自玻片一端輕緩沖洗10～20 s，沖去酸性酒精溶液，瀝干；滴加亞基藍溶液染30～60 s；流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去染液，瀝干，100 倍油鏡觀察，在淡藍色背景下，抗酸桿菌呈紅色，其他細菌及細胞呈藍色。觀察結果按規(guī)程要求進行報告［6］。

1.2.2 GeneXpert法

痰標本：取1 mL 痰標本放置到旋蓋錐形管中，加入2 mL 樣本處理液，使用渦旋儀震蕩10 s，室溫靜置10 min；再次使用渦旋儀震蕩10 s，室溫靜置5 min，直至痰液充分液化，取2 mL完全液化的樣本緩慢加入檢測匣的加樣孔中，使用GeneXpert 儀器進行檢測。

灌洗液：將灌洗液（多于5 mL）轉移至錐形離心管中，3 000g離心15 min，棄上清，加入2 mL樣本處理液并渦旋震蕩，重懸沉淀物，充分混勻，將2 mL經(jīng)過處理的樣本加入試劑匣，GeneXpert進行檢測。

胸腹水：將EDTA 抗凝管收集的胸腹水轉移至錐形離心管中，3 000g離心15 min，棄上清，加入2 mL樣本處理液并渦旋震蕩，重懸沉淀物，充分混勻，將2 mL 經(jīng)過處理的樣本加入試劑匣，GeneXpert 進行檢測。

GeneXpert 檢測結果通過GeneXpert System 測量熒光信號和內(nèi)設的算法來判定，由系統(tǒng)直接報告結果，并在“預覽結果”窗口顯示。較低的CT值代表了較高的DNA模板起始濃度；較高的CT值代表了較低的DNA模板起始濃度。

1.2.3 960分枝桿菌快速培養(yǎng)

痰液、灌洗液：標本使用《大眾健康真菌生物學：實驗室Ⅲ級指南》中推薦的NALC-NaOH 方法進行處理。

體液：用無菌方法采集的標本，即使不經(jīng)過凈化處理也不會有其他細菌被接種到培養(yǎng)管中。若預計標本中包含其他雜菌，則標本必須經(jīng)過凈化處理。

糞便：挑取1 g 糞便放入5 mL 無菌生理鹽水中制備成懸濁液，將懸濁液放在渦旋器上渦旋震蕩5 s，再使用《大眾健康真菌生物學：實驗室Ⅲ級指南》中推薦的NALC-NaOH方法處理標本。

標本處理15～20 min 后，加pH 值為6.8 的磷酸鹽緩沖溶液將經(jīng)過處理的標本混合液稀釋至50 mL。以3 000g離心15 min 后棄上清，然后使用磷酸鹽緩沖溶液1～3 mL 復溶沉淀物制成懸液，在BBLTMMGITTM分枝桿菌7 mL 培養(yǎng)管中加入0.5 mL懸液，并將1 滴（0.1 mL）懸液加入到分枝桿菌固體培養(yǎng)基上。將BBLTMMGITTM分枝桿菌培養(yǎng)管放入BACTECTMMGITTM960分枝桿菌培養(yǎng)檢測儀器，培養(yǎng)管在儀器推薦的42 d 培養(yǎng)周期內(nèi)將被自動檢測。將陽性培養(yǎng)管從儀器中取出，使用快速酸涂片染色法進行復核，觀察涂片和培養(yǎng)結果。

1.2.4 分枝桿菌絕對濃度法藥物敏感性試驗和菌種初步鑒別試驗

取培養(yǎng)陽性的分枝桿菌，調整至規(guī)定濃度，根據(jù)需要接種到相應型號的羅氏培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)28 d，如對照培養(yǎng)基上分枝桿菌生長良好，則根據(jù)對硝基苯甲酸（PNB）和噻吩-2-羧酸肼（TCH）2種鑒別培養(yǎng)基上分枝桿菌生長情況按規(guī)定報告初步鑒別試驗結果。如果2種鑒別培養(yǎng)基上均無分枝桿菌生長報告為牛結核分枝桿菌，如果2 種鑒別培養(yǎng)基上均有分枝桿菌生長報告為非結核分枝桿菌，如果PNB 培養(yǎng)基上無分枝桿菌生長而TCH 培養(yǎng)基有分枝桿菌生長報告為人型結核分枝桿菌。本文對藥敏結果不做討論。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用Excel 軟件進行數(shù)據(jù)整理，使用SPSS25.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用例數(shù)和構成比或率（%）進行描述，兩種檢測方法比較采用配對卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 766例標本GeneXpert與涂片法檢測結果比較

766 例標本分別使用直接涂片抗酸染色鏡檢法和GeneXpert 檢測結核分枝桿菌，其中涂片法和GeneXpert 法均為陽性的有157 例，涂片法陽性GeneXpert 陰性的有27 例，涂片陰性GeneXpert 陽性的有150 例，兩種方法均為陰性的有432 例（表1）。計算得出涂片法的陽性率為24.0%，GeneXpert法的陽性率為40.1%，兩者比較，χ2=85.47，P＜0.001，差異具有統(tǒng)計學意義，提示GeneXpert 法檢測結核分枝桿菌的總體陽性率高于涂片法。涂片法和GeneXpert 聯(lián)合檢測766 例標本，合并陽性率為43.6%，高于兩種方法單獨檢測結核分枝桿菌的檢出率。

表1 766例標本GeneXpert與涂片檢測結果比較（n）

2.2 不同標本類型GeneXpert與涂片法檢測結果比較

473 例痰液的涂片陽性率為29.4%，GeneXpert陽性率39.1%，χ2=24.60，P＜0.01；185例灌洗液涂片陽性率為21.1%，GeneXpert 陽性率為53.0%，χ2=47.68，P＜0.01；61 例胸腹水涂片陽性率為3.3%，GeneXpert 陽性率為19.7%，χ2=8.10，P＜0.01；47 例其他標本類型（包括尿液、腦脊液、糞便、膿液等）的涂片陽性率為8.5%，GeneXpert 陽性率為25.5%，χ2=6.13，P＜0.05；各種標本類型使用兩種檢測方法得出的陽性率差異均具有統(tǒng)計學意義（表2）。

表2 不同類型標本GeneXpert與涂片檢測結果的比較

2.3 460例標本GeneXpert與涂片法、培養(yǎng)法的結果比較

460 例標本同步進行3 種方法檢測結核分枝桿菌，涂片法的陽性率為28.5%（131/460），GeneXpert的陽性率為47.0%（216/460），培養(yǎng)法的陽性率為35.4%（163/460）。涂片法與GeneXpert 比較，χ2=55.15，P＜0.01；GeneXpert 與培養(yǎng)法比較，χ2=21.12，P＜0.01；培養(yǎng)法與涂片法比較，χ2=13.12，P＜0.01；3種方法之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義，且涂片法與GeneXpert 之間的差異高于GeneXpert 與培養(yǎng)法和培養(yǎng)法與涂片法之間的差異。

對上述培養(yǎng)陽性的106 例樣本進一步用分枝桿菌藥敏羅氏培養(yǎng)基進行菌種初步鑒定試驗，得出25 例為非結核分枝桿菌，81 例為結核分枝桿菌。25 例非結核的GeneXpert 和涂片結果分別是：GeneXpert 陽性2 例，陰性23 例；涂片陽性15例，陰性10 例。81 例結核的GeneXpert 和涂片結果分別是：GeneXpert 陽性77 例，陰性4 例；涂片陽性58 例，陰性23 例。由此可得GeneXpert 法的靈敏度和特異度分別為95.1%（77/81）、92.0%（23/25），涂片法的靈敏度和特異度分別為71.6%（58/81）、40.0%（10/25）。

3 討論

檢查結核分枝桿菌傳統(tǒng)的實驗室方法主要有抗酸染色鏡檢法和培養(yǎng)法。鏡檢法雖簡單、價廉，但其對標本的采集和標本含菌量的濃度要求比較高，標本含菌量在5 000～10 000 條/mL 才可檢出陽性，故其靈敏度較低，并且無法區(qū)分結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌。再者，人為因素會影響涂片鏡檢的質量，容易造成漏診和誤診。培養(yǎng)法較抗酸染色鏡檢法靈敏度和特異度都高，是目前診斷結核病的“金標準”方法之一，但其培養(yǎng)過程需1～2個月，不能滿足臨床快速診斷的需求，并且對標本的前處理要求較高，存在一定的污染率［7］。新版的肺結核診斷指南中將結核分枝桿菌的分子生物學陽性作為病原學陽性的診斷依據(jù)［3］，因此許多分子生物學方法如GeneXpert、等溫擴增技術（LAMP）、線性探針技術（HAIN）等在結核病的診斷中得到了應用［8］。GeneXpert 用于檢測結核分枝桿菌和利福平耐藥具有操作簡單（僅需1 個步驟的準備工作）、快速（110 min 就能同時報告結核分枝桿菌及利福平耐藥的結果）和靈敏度高等優(yōu)點［9-10］。

GeneXpert系統(tǒng)可檢測的樣本類型有痰液、胸腹水、肺泡灌洗液、腦脊液、胃液、手術組織、關節(jié)膿液、尿液、大便等。本文對766例不同標本類型分別用涂片法和GeneXpert 法進行檢測，檢出結核分枝桿菌的陽性率GeneXpert 法明顯高于涂片法。對其中460例標本同步進行培養(yǎng)，結果顯示GeneXpert法陽性率明顯高于培養(yǎng)法，可能是因為培養(yǎng)法只能檢測出活菌，其對樣品的采集和前處理有較高的要求。分別對痰液、灌洗液、胸腹水及其他標本類型進行分析，結果發(fā)現(xiàn)GeneXpert 法的陽性率均明顯高于涂片法，差異均具有統(tǒng)計學意義。灌洗液、胸腹水相對于痰液，GeneXpert陽性率與涂片法陽性率的差異更大，這可能是由于本研究在對灌洗液、胸腹水進行直接涂片時未離心，而進行GeneXpert 檢測使用的是離心之后的標本，未離心樣本中結核桿菌濃度低于離心后樣本?？傊?，檢測痰液、灌洗液、胸腹水及其他標本類型中的結核桿菌，GeneXpert法比涂片法的敏感性更高。若將GeneXpert 法與涂片法聯(lián)合使用，能進一步提高結核桿菌的檢出率，對于結核病的快速診斷和早期防控具有重要意義。

本文對106例培養(yǎng)陽性的標本進行了初步的菌種鑒定，比較其GeneXpert 法與涂片法結果，發(fā)現(xiàn)GeneXpert 法對于鑒別結核與非結核分枝桿菌的準確度可達92%以上，與培養(yǎng)法菌種鑒定結果符合率很高。涂片陽性GeneXpert 陰性的27 例，其中包括20 例痰標本和7 例灌洗液，經(jīng)分子生物學方法或培養(yǎng)法鑒定，其中17例痰液和5例灌洗液為非結核分枝桿菌，5例未經(jīng)鑒定。因為GeneXpert系統(tǒng)只能檢測結核分枝桿菌，而不能檢測非結核分枝桿菌，這就提示臨床醫(yī)生涂片陽性且GeneXpert 陰性的患者可能為非結核分枝桿菌感染，應及時進行非結核分枝桿菌的相關檢查，以便及時調整治療方案［11］。同時本研究也存在一定的局限性，首先，未對所有的研究標本進行結核培養(yǎng)，僅有106 例培養(yǎng)陽性的標本進行了初步菌種鑒定，無法全面反映GeneXpert法的準確性；其次，本文中作為金標準的羅氏培養(yǎng)基初步菌種鑒定試驗無法排除結核桿菌與非結核分枝桿菌混合感染的情況，因此當初步菌種鑒定結果為非結核分枝桿菌且GeneXpert 法陽性時，無法判斷GeneXpert 法為假陽性，因此本文獲得的GeneXpert法特異度指標可能存在誤差。

目前GeneXpert 技術在我國正處于推廣階段，但其昂貴的經(jīng)濟成本成為患者和醫(yī)務工作者不得不考慮的因素，也制約了該項技術的大力推廣，并且GeneXpert 無法區(qū)分結核分枝桿菌是否為活菌，所以還需分枝桿菌培養(yǎng)等方法進行聯(lián)合診斷，以獲得更為全面的實驗室依據(jù)。