劉鑒，張文飛

（貴州醫(yī)科大學(xué) 寄生蟲學(xué)教研室，貴州貴陽(yáng) 550001）

阿米巴痢疾是一種常見的寄生蟲腸道感染疾病，它是由內(nèi)阿米巴組的任何變形蟲引起的[1]。2015—2019年，中國(guó)共報(bào)告阿米巴痢疾4 366例，在部分邊遠(yuǎn)落后地區(qū)病例數(shù)較多[2]，所以預(yù)防仍然具有挑戰(zhàn)性。本文通過(guò)生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)了阿米巴痢疾的生物標(biāo)志物，獲得核心基因5個(gè)，對(duì)揭示阿米巴痢疾發(fā)病機(jī)制及預(yù)防非常重要，也為臨床診療提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

從美國(guó)國(guó)家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information ，NCBI）的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）中下載數(shù)據(jù)集GSE23750，該數(shù)據(jù)采用Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array基因表達(dá)芯片平臺(tái)的GPL6422檢測(cè)獲得。數(shù)據(jù)集中結(jié)腸活檢樣本來(lái)自8名急性患者在溶組織內(nèi)阿米巴感染后第1天和第60天進(jìn)行腸道活檢而獲得。

1.2 差異基因的篩選

差異基因篩選數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，通過(guò)R軟件的limma包（Version 4.0.2）進(jìn)行差異基因的分析，以P＜0.05和|log2 fold change|＞1為截?cái)鄻?biāo)準(zhǔn)的基因?yàn)椴町惢颍―ifferentially Expressed Genes，DEPs）；使用Hiplot （https://hiplot.com.cn/online）在線分析工具繪制DEPs火山圖。

1.3 差異蛋白的功能富集分析

利用Hiplot對(duì)DGEs進(jìn)行富集分析并再次進(jìn)行可視化分析，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 核心基因的篩選

將DGEs的基因符號(hào)輸入STRING（https://stringdb.org/，Version 11.0），選擇最小要求的交互得分且中等置信度大于0.4的為顯著性，并利用Cytoscape中的插件分子復(fù)合物檢測(cè)（CytoNCA）挖掘出樞紐基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異基因的篩選

通過(guò)R軟件的limma包進(jìn)行差異基因的分析后，最終得到207個(gè)差異基因，其中上調(diào)的差異基因有125個(gè)、下調(diào)的差異基因有82個(gè)。篩選出的差異基因用于后續(xù)的功能富集及網(wǎng)絡(luò)分析。

2.2 GO功能和KEGG富集分析

為了了解差異基因的功能富集，以P值排名前5的上調(diào)DEPs富集分析結(jié)果（如圖1），發(fā)現(xiàn)neutrophil degranulation、neutrophil activation involved inimmune response、humoral immune response、IL-17 signaling pathway等基因顯著富集。

圖1 基因富集分析結(jié)果

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

獲得5個(gè)核心基因，共18個(gè)節(jié)點(diǎn)，29條邊。核心基因分別為 PTGS2、MMP1、MMP3、MMP10和SERPINE1（圖2）。

圖2 網(wǎng)絡(luò)模塊、分析和中心基因選擇

3 結(jié)論與討論

阿米巴痢疾是由阿米巴原蟲所導(dǎo)致的一種常見寄生蟲腸道感染，是發(fā)展中國(guó)家兒童嚴(yán)重腹瀉的十大原因之一[3-4]。嚴(yán)重的并發(fā)癥包括炎癥和穿孔，導(dǎo)致腹膜炎，甚至導(dǎo)致阿米巴肝膿腫。

本研究利用溶組織內(nèi)阿米巴感染后的基因表達(dá)譜進(jìn)行生物信息學(xué)的分析，篩選出差異基因207個(gè)，其功能主要富集于免疫反應(yīng)的中性粒細(xì)胞活化，體液免疫應(yīng)答，對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)等。獲得5個(gè)核心基因（PTGS2、MMP1、MMP3、MMP10和SERPINE1），提示在阿米巴痢疾的病人中其疾病的發(fā)生發(fā)展受到以上基因組的調(diào)控。

MMP1、MMP3和MMP10參與正常生理過(guò)程以及疾病過(guò)程中細(xì)胞外基質(zhì)的分解，與傷口修復(fù)、動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展和腫瘤發(fā)生有關(guān)，可作為多種疾病的潛在生物標(biāo)志物[5-6]。本研究中，作為差異基因參與膠原蛋白的分解，說(shuō)明阿米巴痢疾的發(fā)生發(fā)展被該家族成員所調(diào)控，參與了阿米巴感染后結(jié)腸的炎癥反應(yīng)。

PTGS2是前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶的同工酶，參與炎癥反應(yīng)。在多種疾病中均發(fā)揮重要作用。在結(jié)直腸癌（CRC）患者中，PTGS2表達(dá)與CRC患者的生存期較差有關(guān)，抑制PTGS2活性可發(fā)揮其抗炎和抗腫瘤作用[7]。通常，宿主會(huì)對(duì)腸阿米巴做出免疫反應(yīng)以清除病原體[4]，巨噬細(xì)胞在宿主對(duì)抗腸阿米巴病的反應(yīng)中也起著至關(guān)重要的作用。用IFN-γ或TNF-α刺激巨噬細(xì)胞后具有殺滅阿米巴的作用[8]，雖然TNF-α?xí)碳ぶ行粤＜?xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放ROS和NO來(lái)對(duì)抗寄生蟲，但過(guò)量的TNF-α?xí)?dǎo)致對(duì)宿主組織的直接損傷[9]。

綜上所述，使用生物信息學(xué)方法篩選了阿米巴痢疾發(fā)病過(guò)程中的差異基因，并篩選出核心基因作為潛在的生物標(biāo)記物，分析了其生物學(xué)功能，為阿米巴痢疾的發(fā)病機(jī)制及預(yù)防提供了新的參考。