彭婷，范燕華

(1.福建醫(yī)科大學(xué) 免疫治療研究院，福建福州 350122；2.福州黎明職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)系，福建福州 350109)

嗜鉻細(xì)胞瘤是一種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，它會波動性地釋放出兒茶酚胺類物質(zhì)［主要包括腎上腺素（Epinephrine，E）、去甲基腎上腺素（Norepinephrine，NE）等］，兒茶酚胺又進(jìn)而代謝產(chǎn)生3-甲氧基腎上腺素（Metanephrine，MN）和3-甲氧基去甲腎上腺素（Normetanephrine，NMN）進(jìn)入血液中，從而引起高血壓、器官功能減退、心腦血管疾病，嚴(yán)重時甚至危及生命[1]。因此，越早診斷出是否有嗜鉻細(xì)胞瘤，就越能阻止病情發(fā)展，治愈率就越高[2]。

研究發(fā)現(xiàn)，通過檢查血漿或尿液中兒茶酚胺類物質(zhì)（E和NE）的濃度來診斷嗜鉻細(xì)胞瘤的符合率分別為84%和86%，而檢查血漿、尿液中兒茶酚胺的代謝產(chǎn)物MN和NMN的濃度來診斷時，符合率則分別為99%和97%[3-4]。因此，本文主要采用固相萃取法提取人血漿中的MN和NMN，再利用高效液相聯(lián)合電化學(xué)檢測器的方法測定MN和NMN的濃度，并對其方法專屬性、回收率進(jìn)行研究[5-6]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 儀器

高效液相色譜系統(tǒng)（包括LC-20AB泵，SIL-20A進(jìn)樣器，CTO-10Asvp柱溫箱，DGU-20A3自動脫氣裝置），日本島津公司；Waters 2465 電化學(xué)檢測器，日本島津公司；色譜柱：Shim-Pack VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）分析柱，島津（上海）實驗器材有限公司；保護柱：Shim-Pack GVP-ODS（10 L×4.6 mm，P/N 228-34938-91），島津（上海）實驗器材有限公司；XW-80A旋渦混合器，上海精科實業(yè)有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；CP114電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司；Waters OASIS WCX Cartridge固相萃取陽離子交換小柱，上海楚定分析儀器有限公司；TGL-18G高速臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；HSC-12A氮吹儀，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；HYC-326A型醫(yī)用冷藏箱，青島海爾特種電器有限公司；MDF-U53V型醫(yī)用低溫箱，日本三洋電機株式會社。

1.1.2 試劑

3-甲氧基腎上腺素鹽酸鹽（083M4610V）、3-甲氧基去甲腎上腺素鹽酸鹽（SHBC4332V）和3,4-二羥基芐胺（MKAA3430V），sigma；甲醇，色譜級，賽默飛；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

進(jìn)樣量：60 μL；流速：1.000 0 mL/min；電化學(xué)檢測器：顯示范圍為0～2 nA，池電位0.75 V，過濾時間0.1 s；柱溫：30 ℃；流動相配制：取檸檬酸11.00 g、無水乙酸鈉4.00 g、EDTA-2Na 0.12 g、1-辛烷磺酸鈉0.24 g及氯化鈉1.16 g，用無菌注射用水溶解后加入甲醇35.00 mL配制成1 L溶液，抽濾后存放于冰箱保鮮層[7]。

1.2.2 對照品儲備液的制備

精密稱取偏重亞硫酸鈉0.025 g，加入20 mL 0.02 mol/L的HCl，混勻備用（A液）；分別精密稱取NE、E、NMN、MN 10.0 mg，用適量A液溶解后加入10 mL的棕色容量瓶中定容得1.00 mg/mL的NE、E、NMN、MN儲備液。4 ℃避光保存。

1.2.3 血樣前處理及測定

取全血5 mL，10000 r/min離心3 min，取上血漿。取2 mL血漿樣品，并用2 mL無菌注射用水稀釋，然后裝到陽離子交換柱進(jìn)行固相萃取。分別用2 mL注射用無菌水和1 mL甲醇洗滌并抽干。用4%甲酸甲醇溶液（0.5 mL）洗脫。用氮氣將洗脫液吹干，然后用100 μL高氯酸（0.1 mol/L）進(jìn)行復(fù)溶，并在“1.2.1”色譜條件下進(jìn)樣測定[8]。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制MN濃度分別為100 pg/mL、200 pg/mL、400 pg/mL、800 pg/mL、1 600 pg/mL 和 3 200 pg/mL，NMN濃度分別為50 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL、400 pg/mL、800 pg/mL、1 600 pg/mL和 3 200 pg/mL的梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液。添加0.05 mL內(nèi)標(biāo)溶液3,4-二羥基芐胺（DHBA），同“1.2.2”中血樣前處理方法進(jìn)行處理及測定。橫坐標(biāo)為血漿MN（或血漿NMN）濃度，縱坐標(biāo)為色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比，繪制工作曲線[8]。

1.2.5 回收率

1.2.5.1 提取回收率

以血漿為溶劑，配制含MN和NMN的濃度均為200 pg/mL、800 pg/mL及1 600 pg/mL的溶液各5份，按上述方法萃取后上色譜儀分析，同時取15份空白血漿，以“1.2.2”的方法進(jìn)行樣品前處理，氮氣儀吹干，分為3組，每組5份，分別加入同樣濃度MN和NMN的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在相同條件下進(jìn)樣分析。按照公式（1）計算提取回收率[9]。

1.2.5.2 方法回收率

以血漿為溶劑，配制含MN和NMN的濃度均為200 pg/mL、800 pg/mL及1 600 pg/mL的溶液各5份，萃取后進(jìn)行高效液相分析，再根據(jù)回歸方程計算濃度，用公式（2）計算方法回收率[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍

橫坐標(biāo)為血漿MN（或血漿NMN）濃度，縱坐標(biāo)為峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比，作回歸方程。MN血漿溶液的線性回歸方程：y=0.0029x+0.4002，R2=0.9972，具有較好的線性關(guān)系；NMN血漿溶液的線性回歸方程：y=0.007 5x+0.244 6，R2=0.999 6，具有較好的線性關(guān)系。實驗結(jié)果說明檢測方法準(zhǔn)確性較高。

2.2 方法專屬性

圖1為MN和NMN溶液直接過柱進(jìn)樣的色譜圖，MN峰形良好，保留時間為21.579 min；NMN峰形良好，保留時間為15.311 min；圖2結(jié)果顯示，在保留時間21.579 min和15.311 min處，沒有其他物質(zhì)出峰，說明血漿溶劑對MN和NMN的檢測不構(gòu)成干擾。圖3結(jié)果顯示，含MN和NMN血漿中兩種物質(zhì)的保留時間與圖1相同，峰形也較好。圖4結(jié)果顯示，NE、E、NMN和MN之間分離良好，也不干擾MN和NMN的測定。

圖1 MN和NMN溶液直接過柱進(jìn)樣的色譜圖

圖2 空白血漿的色譜圖

圖3 MN和NMN血漿樣品過柱進(jìn)樣的色譜圖

圖4 NE、E、NMN、MN和DHBA混合進(jìn)樣的色譜圖

2.3 提取回收率及方法回收率

表1為MN的回收率實驗結(jié)果，MN的提取回收率分別為82.68%、84.00%和86.35%，平均值為84.34%；方法回收率分別為99.22%、99.55%和98.67%，平均為99.10%。表2顯示，NMN的提取回收率分別為86.18%、93.55%和91.92%，平均為90.55%；方法回收率分別為101.58%、99.89%和99.96%，平均為100.48%。由此可見，采用上述實驗方法萃取及測定的提取回收率和方法回收率均較高，可滿足實際樣品測試需求。

表1 MN的回收率

表2 NMN的回收率

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

研究發(fā)現(xiàn)，流動相中甲醇及1-辛烷磺酸鈉（離子對色譜試劑）的用量改變會引起NMN和MN的保留時間改變，增加甲醇及1-辛烷磺酸鈉的用量，NMN和MN的保留時間延長。經(jīng)過多次實驗發(fā)現(xiàn)，1 L溶液中1-辛烷磺酸鈉0.24 g，甲醇70 mL為較適宜用量。

3.2 血樣前處理方法的優(yōu)化

本實驗最初采用以下方法處理血樣：甲醇2 mL沖SPE小柱，水1 mL沖柱；血漿樣品2.000 mL，加入0.050 mL內(nèi)標(biāo)溶液DHBA混勻，上柱；用2 mL水和1 mL甲醇沖洗并抽干；經(jīng)4%的甲酸甲醇溶液（0.5 mL）洗脫，將洗脫液進(jìn)行色譜分析。

這種方法回收率較低，經(jīng)多次探索后，主要改進(jìn)了3處：（1）將原方法中活化固相萃取陽離子交換小柱方法改為依次用1 mL甲醇、3 mL水、2 mL甲醇、1 mL水沖柱，這種方式可將柱中殘留的雜質(zhì)完全洗脫且使小柱活化更充分，回收率更為穩(wěn)定；（2）在上柱前將2 mL血漿樣品加滅菌注射用水2 mL稀釋后再上柱，可以防止柱子堵塞，并保證血漿中NMN和MN充分與柱子結(jié)合；（3）將收集后的洗脫液置于氮吹儀下?lián)]干，用100 μL高氯酸（0.1 mol/L）復(fù)溶，經(jīng)預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)揮干甲醇后復(fù)溶不影響NMN和MN穩(wěn)定性，且可提高回收率，加大進(jìn)樣濃度。

此外，預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)：（1）過柱前，分別用20 μL、濃度為 2×10-1mol/L、2×10-2mol/L、2×10-3mol/L、2×10-4mol/L和2×10-5mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)血漿樣品pH值，結(jié)果證明血漿樣品直接過柱回收率最高；（2）使用500 μL的4%甲酸甲醇溶液可充分洗脫柱子內(nèi)的NMN和MN；（3）將收集后的洗脫液置于氮吹儀下?lián)]干后，分別用等體積滅菌注射用水、4%甲酸甲醇溶液、0.1%醋酸溶液、0.1 mol/L高氯酸、0.02 mol/L鹽酸進(jìn)行復(fù)溶，結(jié)果顯示0.1 mol/L高氯酸復(fù)溶時回收率最高且最穩(wěn)定。

3.3 血漿樣品存儲時間的影響

室溫放置24 h后樣品的測定結(jié)果不穩(wěn)定，采集血樣后應(yīng)及時放入冰盒內(nèi)送檢；如不能及時檢測，應(yīng)將全血離心后，取足量上層血漿置于-80 ℃冰箱內(nèi)冷凍保存；樣品處理后高氯酸復(fù)溶室溫放置24 h的測定結(jié)果也不穩(wěn)定，可能是由于室溫放置時MN和NMN會發(fā)生氧化等反應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究通過固相萃取-高效液相-電化學(xué)檢測器聯(lián)用法測定人血漿中MN和NMN的濃度，得到MN線性方程：y=0.0029x+0.4002(R2=0.9972)；NMN線性回歸方程：y=0.0075x+0.2446(R2=0.9996)，具有較好的線性關(guān)系。在該實驗條件下，MN和NMN峰形良好，保留時間分別為21.579 min和15.311 min，血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)及兒茶酚類物質(zhì)均不干擾測定。MN和NMN的平均提取回收率分別為84.34%和90.55%，平均方法學(xué)回收率分別為99.10%和100.48%，均得到較高的回收率。

測定MN和NMN來鑒別與診斷嗜鉻細(xì)胞瘤相較利用陽離子交換-高效液相色譜-電化學(xué)法測定患者的兒茶酚胺（E和NE）陽性率更高[8]，而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定血漿中MN和NMN方式復(fù)雜，操作煩瑣[7]。本實驗建立采用固相萃取人血漿中MN和NMN，用高效液相色譜與電化學(xué)檢測器聯(lián)用的方法檢測其濃度，方法準(zhǔn)確可靠，回收率也較高。

后期將進(jìn)一步對其進(jìn)行特異性和敏感性檢驗等方面的完善，以期為臨床嗜鉻細(xì)胞瘤的檢測提供方法學(xué)參考。