劉曉曉，張紅軍，張非凡，李嘉琪，王雅欣，賀小平，董賢慧

（河北中醫(yī)學(xué)院 河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊 050000）

阿爾茨海默病（Alzheimer's Disease，AD）是一種多病因介導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，會(huì)導(dǎo)致患者的認(rèn)知、記憶、語(yǔ)言功能發(fā)生障礙。AD的主要病理學(xué)標(biāo)志是腦內(nèi)老年斑（Senile Plaque，SP）的出現(xiàn)，其核心成分是Aβ。研究表明[1]，AD治療的關(guān)鍵在于如何抑制Aβ的生成和代謝。

研究發(fā)現(xiàn)，淫黃葛合劑可以有效上調(diào)HAMP基因的表達(dá)[2]，緩解小鼠腦組織鐵超載，下調(diào)AD小鼠模型Aβ的表達(dá)、減少老年斑的沉積，同時(shí)明顯改善AD學(xué)習(xí)記憶能力，但其具體機(jī)制仍然不明確。

因此，課題組以Aβ25-35誘導(dǎo)HT22細(xì)胞為AD細(xì)胞模型，淫羊藿、黃芪、葛根素活性成分制成合劑，采用Real-Time PCR分析淫黃葛合劑誘導(dǎo)HAMP對(duì)HT22細(xì)胞APP水解中關(guān)鍵酶BACE1表達(dá)的影響，以期為AD的治療提供新的思路和策略。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22，由河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

DMEM高糖培養(yǎng)基，Gibco公司；青鏈霉素混合液，BIOND公司；3111型二氧化碳培養(yǎng)箱，芬蘭Thermo公 司；PrimeScriptTM reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒、TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ （Tli RNaseH Plus）試劑盒，TaKaRa公司；DM5000B型光學(xué)顯微鏡、DMI3000B倒置顯微鏡，德國(guó)Leica公司；H2050R型離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Aβ25-35，Sigma公司；CCK-8試劑盒，莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司。

1.2 HT22細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理

將HT22細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，加入培養(yǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后，放入培養(yǎng)瓶中，置于CO2培養(yǎng)箱中，調(diào)好所需的溫度與CO2濃度進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞融合后進(jìn)行傳代處理。選取形態(tài)良好、處于生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

前期發(fā)現(xiàn)[3]，淫黃葛合劑作用濃度為25 μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞安全性最好，因此選取25 μmol/L作為淫黃葛合劑作用濃度。前期試驗(yàn)證明，HAMPsiRNA-3序列對(duì)HAMP的表達(dá)作用干擾最強(qiáng)，故選用HAMPsiRNA-3序列沉默HAMP基因。隨機(jī)將HT22細(xì)胞分為7組：正常組為不處理的完全培養(yǎng)基，Aβ組用Aβ25-35處理，RNAi組用HAMP-siRNA-3干擾，Aβ+RNAi組用Aβ25-35處理后轉(zhuǎn)染HAMP-siRNA-3，Aβ+TCM組用Aβ25-35處理后淫黃葛合劑處理，RNAi+TCM組用HAMP-siRNA-3處理后淫黃葛合劑處理，Aβ+RNAi+TCM組用Aβ25-35處理24 h后HAMP-siRNA-3處理后淫黃葛合劑處理。

1.3 Real-Time PCR檢測(cè)BACE1的表達(dá)

細(xì)胞處理后，收集各組處理后的HT22細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。用試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，并進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，用2-△△CT表示待測(cè)樣品中目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)數(shù)量，內(nèi)參GAPDH、BACE1引物序列見表1。

表1 內(nèi)參GAPDH、BACE1引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

Real-Time PCR結(jié)果表明（見圖1）：與對(duì)照組比較，AD細(xì)胞模型組中BACE1表達(dá)增加（P＜0.05），給予AD細(xì)胞模型組中藥后，BACE1表達(dá)降低（P＜0.05），說(shuō)明中藥可以通過(guò)抑制BACE1的表達(dá)，減少淀粉樣代謝通路；與RNAi組比較，Aβ+RNAi中的BACE1表達(dá)增加（P＜0.05），說(shuō)明HAMP抑制BACE1的表達(dá)；與Aβ+RNAi組比較，Aβ+RNAi+TCM組中的BACE1的表達(dá)降低（P＜0.05），說(shuō)明中藥可以使HAMP表達(dá)上調(diào)，從而減少淀粉樣代謝通路的產(chǎn)生。

圖1 中藥對(duì)APP水解HT22細(xì)胞BACE1mRNA表達(dá)的影響

3 討論

老年期癡呆的50%～70%為AD的發(fā)生[4]，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生退行性改變，認(rèn)知、記憶、語(yǔ)言功能發(fā)生障礙[5]，使老年人的生活質(zhì)量大幅度降低，幸福感下降?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為聯(lián)合使用藥物治療、非藥物治療和細(xì)心護(hù)理能夠減輕AD癥狀和延緩病情發(fā)展，尚無(wú)特效藥能治愈AD或者有效逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)程[6-8]。

中醫(yī)辨證論治認(rèn)為AD病位在腦，根本責(zé)之于腎?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》不僅指出“腎主藏精”生理功能，還指出腎精盈虧在腦病發(fā)生、發(fā)展中的重要地位，提出腦與腎二者之間的關(guān)系，強(qiáng)調(diào)先天腎精在智力發(fā)展中的重要作用[9]。脾胃虛弱亦會(huì)致痰濕內(nèi)蘊(yùn)，明代《醫(yī)學(xué)正傳》中指出津液性質(zhì)稠黏時(shí)則變?yōu)樘?、飲，停駐過(guò)久則和血液相互為用，可隨氣機(jī)上升淤塞腦竅，發(fā)為“癡呆”。AD辨證為腎虛精虧，氣血不足，痰瘀互結(jié)，濁毒內(nèi)生本虛標(biāo)實(shí)之證[10-11]。根據(jù)中醫(yī)思維治療AD應(yīng)強(qiáng)腎補(bǔ)脾、補(bǔ)氣養(yǎng)血以培其本，化解痰、祛除瘀、解大毒以治其標(biāo)[12-13]。遂選取具備強(qiáng)腎補(bǔ)精、生精生髓之功效的淫羊藿作為君藥；具備補(bǔ)氣健脾、行血化瘀之功效的黃芪作為臣藥；具備清熱、降火、排毒之功效的葛根作為佐藥[14]，提取有效成分制成合劑，既克服了傳統(tǒng)中藥方劑的缺點(diǎn)，又繼承了傳統(tǒng)方劑多效性的優(yōu)點(diǎn)，用現(xiàn)代科學(xué)解讀中醫(yī)藥作用原理。

AD患者的主要病理學(xué)表現(xiàn)為神經(jīng)炎性斑的出現(xiàn)，Aβ在AD的發(fā)病過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用[15-16]，Aβ是其前體蛋白APP經(jīng)3種不同分泌酶進(jìn)行分解代謝產(chǎn)生的[17]，其有兩條代謝通路，最直觀的是APP的淀粉樣代謝通路。首先β分泌酶在BACE1位點(diǎn)進(jìn)行剪切，將sAPPβ蛋白排出胞外，留在胞內(nèi)的C99片段由γ分泌酶剪切為Aβ多肽。此通路一直被認(rèn)為是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，已成為本病的主要治療靶點(diǎn)[18]。

BACE1是β分泌酶的一種，其參與APP的水解過(guò)程生成Aβ。研究表明，BACE1敲除的小鼠檢測(cè)不到Aβ[19]。敲除BACE1基因后，Aβ產(chǎn)生顯著減少。在抑制BACE1的表達(dá)時(shí)，AD模型動(dòng)物的認(rèn)知功能障礙明顯得到改善[20]。

鐵是維持正常生理細(xì)胞功能所需的重要微量營(yíng)養(yǎng)素，并參與神經(jīng)系統(tǒng)中髓鞘和各種神經(jīng)遞質(zhì)的合成[21]。腦鐵含量異常在AD發(fā)生病理變化中扮演著重要角色[22-23]。腦鐵含量的異常升高促進(jìn)了AD的發(fā)展，進(jìn)而引發(fā)一連串的體內(nèi)放大機(jī)制，并最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡[24]。

鐵穩(wěn)態(tài)的維持只能通過(guò)調(diào)節(jié)鐵的吸收來(lái)完成，HAMP在維持鐵代謝穩(wěn)定中起著重要作用[25]。調(diào)整AD模型小鼠腦組織Aβ的表達(dá)形式，其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)AD模型小鼠腦組織鐵泵蛋白FPN1和鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的表達(dá)形式關(guān)系密切[26]。HAMP基因編碼鐵調(diào)素蛋白，通過(guò)結(jié)合并促進(jìn)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白降解，減少細(xì)胞表面鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的含量，從而降低血清鐵含量，維持細(xì)胞內(nèi)正常的鐵元素代謝過(guò)程，是重要的調(diào)節(jié)鐵元素的激素[27]。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，淫黃葛合劑可以通過(guò)誘導(dǎo)HAMP的產(chǎn)生，降低腦中鐵的含量，抑制BACE1的表達(dá)和Aβ的生成，從而改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。下一步需要對(duì)合劑中不同組分、不同劑量的組合分開進(jìn)行測(cè)試，篩選功能成分，優(yōu)化合劑組方配伍，進(jìn)一步提高淫黃葛合劑在預(yù)防和治療阿爾茨海默病方面的應(yīng)用價(jià)值。