鄭凌琦 劉艷霞 黃文玲 徐彩 趙嘉靜

由于生育年齡推遲以及全面開放“二孩”政策，有生育需求的高齡女性顯著增多[1-2]，因卵巢衰老而出現(xiàn)的卵細胞質(zhì)量下降是導致不孕及輔助生殖技術(shù)失敗的主要原因。近年來，自然環(huán)境的污染，女性社會角色變化、精神壓力的增加、婦科手術(shù)操作的增加等因素，卵巢儲備功能下降(Diminished ovarian reserve, DOR)發(fā)病率呈逐年上升趨勢[3]，這類患者在助孕促排卵過程中，容易發(fā)生卵巢低反應、卵母細胞數(shù)少等問題[4-5]。已有大量臨床研究證明，中醫(yī)治療DOR往往能取得良好的治療效果，甚至恢復生育功能，中醫(yī)藥在輔助生殖技術(shù)中改善卵巢功能的作用逐漸被醫(yī)學界認可[6]。

烏萸湯是國家級名老中醫(yī)金哲教授經(jīng)驗方，以“補腎調(diào)肝”為法，臨床收效顯著。課題組前期研究顯示，該方能夠通過調(diào)整下丘腦—垂體—卵巢軸，有效改善卵巢功能，緩解臨床癥狀[7-8]，還可影響高齡小鼠卵母細胞的線粒體功能，促進卵母細胞成熟。[9]本研究在此基礎上，通過觀察DOR小鼠促排卵情況及卵巢儲備功能，探討烏萸湯對DOR小鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6J健康小鼠，其中雌性24周齡12只、6周齡6只，雄性6周齡3只。動物廠家許可證號：斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，SCXK(京)2019-0010。以上動物均飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院實驗中心動物屏障系統(tǒng)內(nèi)，SPF環(huán)境，12小時明/暗，動物自由攝食飲水。

1.2 試劑及實驗器材

主要試劑：妊馬雌酮(寧波三生生物科技有限公司，S200808)，人絨毛膜促性腺激素(寧波三生生物科技有限公司，B200805)；精子獲能液(Sigma，S7920)；人類輸卵管液(Sigma，G5149)；抗繆勒管激素(anti miillerrian hormone，AMH)試劑盒(江萊生物，JL20476)；α-tubulin(CST，#5335)；Ki67(賽維爾生物，GB111141)；HRP標記山羊抗兔(賽維爾生物，GB23303)；CY3-山羊抗兔(賽維爾生物，GB21303)；FITC-山羊抗兔(賽維爾生物，GB25303)；DAPI(賽維爾生物，G1012)。

主要器材：超凈工作臺(蘇州凈化SW-CJ-1FD，中國)；二氧化碳培養(yǎng)箱(SANYO XD-101，日本)；生物倒置顯微鏡(OLYMPUS，IX51，德國)；體式顯微鏡(世紀科信，中國)；酶標儀(Thermo，型號：MULTISKAN MK3)；熒光顯微鏡(OLYMPUS-IX51，德國)；臺式低速離心機(上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設備廠80-2，中國)。

1.3 實驗藥物及制備

烏萸湯(烏藥10 g、山茱萸10 g、菟絲子15 g、丹參10 g、雞血藤15 g、肉蓯蓉10 g、香附10 g，東方醫(yī)院顆粒藥房提供，康仁堂藥業(yè)生產(chǎn))，取中藥顆粒劑1袋(相當于原藥材40 g)加蒸餾水震蕩混勻配置成20 mL灌胃湯藥，配成2 g/mL藥液，4℃儲存?zhèn)溆谩?000 U的孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)溶于0.9%氯化鈉溶液10 mL中，配成濃度為100 U/mL的PMSG溶液備用。1000 U的人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)溶于0.9%氯化鈉溶液10 mL中，配成濃度為100 U/mL的HCG溶液備用。

1.4 動物造模及分組

所有小鼠適應性飼養(yǎng)1周后進入實驗。采用“陰道脫落細胞涂片法”觀察15天，觀察實驗雌鼠動情周期變化，參考繆晨韻等[10]方法，如出現(xiàn)動情周期紊亂或動情間期延長，則為DOR造模成功。本實驗選取SPF級C57BL/6J的24周齡健康小鼠全部造模成功，均進入實驗。

采用隨機數(shù)字表法將12只24周齡C57BL/6J雌性小鼠隨機分為高齡組和治療組，6周齡C57BL/6J雌性小鼠為青年組，每組小鼠6只。另外3只6周齡C57BL/6J雄性小鼠單獨飼養(yǎng)，用于體外受精實驗。

1.5 給藥、促排與取材

烏萸湯的小鼠臨床等效劑量根據(jù)李玲等[7]實驗研究最優(yōu)藥效濃度，即生藥40 g/(kg·d)，按照0.2 mL/10(g·d)灌胃，對照組、高齡組均用等量蒸餾水灌胃，各組均連續(xù)灌胃8周。所有雌鼠灌胃第54天17:00腹腔注射10 U的妊馬雌酮，48小時后腹腔注射10 U的HCG[11]，16小時后摘眼球取血并頸椎脫臼處死。取得血液離心后用于血清AMH檢測；取輸卵管壺腹部收集并處理卵丘復合物，用于體外受精實驗；取卵后的一側(cè)卵巢制作HE染色切片，另一側(cè)制作熒光染色切片。

將5只6周齡雄性小鼠頸椎脫臼處死，取出附睪，剔除周圍結(jié)締組織并清洗干凈，在精子獲能液培養(yǎng)皿中將附睪剪破，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中獲能1小時。用移液槍將培養(yǎng)皿中精液轉(zhuǎn)移至EP管中，靜置10分鐘。吸取EP管上1/3的液體，滴在培養(yǎng)皿蓋子上，在倒置顯微鏡下觀察精子密度和活力，取其中密度適中、活力佳的精子用于體外受精實驗。

1.6 指標檢測

1.6.1 抗苗勒氏管激素檢測 小鼠血清AMH水平采用ELISA法檢測，用抗繆勒管激素試劑盒，按照說明書操作檢測。

1.6.2 卵母細胞數(shù)、成熟卵個數(shù)、受精卵個數(shù)統(tǒng)計 分離取出的輸卵管壺腹部，放置于含人輸卵管液滴的無菌培養(yǎng)皿中，并置于體式顯微鏡下以1 mL注射器的針頭輕輕劃開輸卵管壺腹部隆起處，暴露白色絮狀卵丘團，以200 μL移液槍將卵母細胞團拖入液滴中，5～10分鐘后顯微鏡下計數(shù)。取密度適中、活力佳的精子4 μL，加入含有卵丘團的HTF(human tubal fluid)受精液滴中，置于37℃、5%二氧化碳的胚胎培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4小時后在體式顯微鏡下用口吸管撿卵，每個受精卵洗滌3遍后計數(shù)。成熟率=成熟卵個數(shù)/卵母細胞個數(shù)×100%，受精率=受精卵個數(shù)/成熟卵個數(shù)×100%。

1.6.3 卵巢HE染色 小鼠卵巢組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，并進行石蠟切片脫蠟和水化，蘇木素染液染色，再進行脫水和透明，中性樹膠封片，最后顯微鏡觀察并拍照，觀察卵巢組織形態(tài)及初級卵母細胞。

1.6.4 卵巢免疫熒光染色 小鼠卵巢組織制作石蠟切片并脫蠟水化，抗原修復血清封閉30分鐘，加入一抗α-tubulin+Ki67(1∶600+1∶10000稀釋)4℃孵育過夜，加入二抗HRP(1∶500稀釋)、CY3(1∶300稀釋)、FITC(1∶400稀釋)，室溫孵育50分鐘，用DAPI染核后封片，熒光顯微鏡觀察并測量其各種熒光染色陽性細胞數(shù)。α-tubulin陽性表達率=α-tubulin陽性細胞數(shù)/DAPI總細胞數(shù)×100%，Ki67陽性表達率=Ki67陽性細胞數(shù)/DAPI總細胞數(shù)×100%。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠動情周期比較

對干預前的各組小鼠動情周期進行比較，高齡組、治療組小鼠動情周期與青年組相比有明顯延長，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高齡組、治療組之間差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，證實該實驗造模成功。見表1。

表1 各組小鼠動情周期比較

2.2 各組小鼠血清AMH含量

小鼠摘眼球取血離心后，按照血清AMH檢測試劑盒進行檢測計算，高齡組較青年組血清AMH有明顯降低(P<0.05)，治療組較高齡組血清AMH有明顯升高(P<0.05)，但是治療組與青年組相比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血清AMH水平

2.3 各組小鼠生殖功能檢測

對各組小鼠卵母細胞數(shù)、成熟卵數(shù)、受精卵數(shù)進行統(tǒng)計，與青年組相比，高齡組、治療組成熟率及受精率均有降低(P<0.05)，與高齡組相比，治療組的卵母細胞成熟率有所升高(P<0.05)，但受精率無明顯差異。見表3。

表3 各組小鼠成熟卵及受精卵比率比較[個(%)]

2.4 各組小鼠卵巢HE染色

各組小鼠一側(cè)卵巢進行HE染色觀察。鏡下觀察可見，青年組小鼠卵巢結(jié)構(gòu)清楚，形態(tài)正常，卵巢皮質(zhì)髓質(zhì)分布正常，各級卵泡均可見，其中，原始卵泡核大而圓，生長卵泡透明帶明顯顆粒細胞豐富。高齡組卵巢略萎縮，髓質(zhì)組織多，各級卵泡數(shù)目整體偏少，雖有生長卵泡，但其形態(tài)欠規(guī)整，顆粒細胞層數(shù)減少，閉鎖卵泡較多。治療組卵巢結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)基本正常，與高齡組比較，其髓質(zhì)減少，生長卵泡細胞完整，呈橢圓形，但卵泡腔較小，且透明帶顆粒細胞不豐富。見圖1。

注： A：青年組；B: 高齡組；C: 治療組

2.5 各組小鼠卵巢免疫熒光染色

各組小鼠另一側(cè)卵巢制片后進行熒光染色，DAPI、α-tubulin和Ki67分別顯色為藍色、紅色、綠色，對其進行陽性細胞數(shù)統(tǒng)計。與青年組相比，高齡組α-tubulin陽性表達率有明顯降低(P<0.05)，治療組較高齡組有所升高(P<0.05)，治療組和青年組之間差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與青年組相比，高齡組和治療組Ki67陽性表達率有明顯降低(P<0.05)，且治療組較高齡組有所升高(P<0.05)。(見表4、圖2)。

表4 α-tubulin、Ki67染色陽性分析[個(%)]

圖2 α-tubulin、Ki67熒光染色圖(×40)

3 討論

DOR患者的卵母細胞數(shù)量減少和質(zhì)量下降，常表現(xiàn)為月經(jīng)周期紊亂，對卵巢刺激反應欠佳、高流產(chǎn)風險甚至不孕[12]，同時伴有AMH水平降低、竇卵泡數(shù)減少、促卵泡生成素水平升高[13]。DOR并無中醫(yī)病名，根據(jù)患者經(jīng)常出現(xiàn)的癥狀等臨床表現(xiàn)，將其歸屬于“月經(jīng)量少”“月經(jīng)后期”和“不孕癥”等范疇。現(xiàn)代女性生活、工作壓力較大，生育之心不遂，故認為腎虛是其病理根源，肝郁是其持續(xù)存在的生理病理狀態(tài)。臨床中，本課題組以補腎調(diào)肝法為基本治法，方用國家級名老中醫(yī)金哲教授經(jīng)驗方——烏萸湯。該方補腎以助先天，調(diào)肝以暢氣血，而奏調(diào)經(jīng)種子之效。課題組前期研究顯示：烏萸湯可提高卵巢衰老及卵巢不敏感綜合征模型小鼠血清雌激素水平，降低促卵泡生成素、促黃體生成素水平；上調(diào)卵巢抑制素B及卵泡抑素水平，下調(diào)激活素水平，有效改善卵巢功能[7-8]。

卵巢儲備功能及卵巢反應性能夠明確反映女性的生育潛能。卵巢儲備功能指卵巢皮質(zhì)內(nèi)卵泡生長、發(fā)育進而形成能夠受精卵母細胞的能力，其中卵巢內(nèi)存留卵泡的質(zhì)量與數(shù)量是女性生育功能的重要標志[14]。血清AMH的數(shù)值不隨月經(jīng)周期而變化，反映了竇卵泡的發(fā)育及原始卵泡的募集能力[15]；卵巢的形態(tài)學能夠直觀的觀察到卵巢的各級卵泡形態(tài)、數(shù)目。而卵巢反應性是指女性在控制性超促排卵時，卵巢對促性腺激素的反應，卵巢反應性降低，促排后受精實驗結(jié)果較差，卵母細胞數(shù)、成熟個卵數(shù)、受精卵個數(shù)均有所減少[16]。

實驗顯示，DOR小鼠血清AMH降低，卵巢內(nèi)各級卵母細胞數(shù)量減少、形態(tài)不佳，卵巢組織的α-tubulin及Ki67表達下降，提示了DOR小鼠的細胞增殖能力降低及卵巢儲備功能下降。DOR小鼠生殖功能檢測顯示其促排后卵母細胞數(shù)、成熟卵數(shù)、受精卵數(shù)明顯減少，其卵巢反應性降低。而烏萸湯可以提高小鼠血清AMH的水平，增加卵巢內(nèi)啟動生長的卵泡數(shù)，通過改善細胞的增殖能力，刺激卵巢內(nèi)原始卵泡的發(fā)育，改善卵泡質(zhì)量，增加小鼠的卵巢反應性，促進卵泡的生長、成熟和排出。由此可見，烏萸湯能夠改善DOR小鼠卵巢儲備功能及卵巢低反應狀態(tài)，從而提高生殖能力。