汪 楠，陸 曄，郝風(fēng)節(jié)，王俊青

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院普外科，上海 200025

他汀類藥物是肝臟合成膽固醇的限速酶——羥基甲基戊二酰輔酶A （3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMG-CoA）還原酶的抑制劑，不僅能有效抑制膽固醇和低密度脂蛋白合成，還能輕度降低三酰甘油和升高高密度脂蛋白含量，是臨床上廣泛使用的調(diào)脂藥物［1］。肝纖維化是臨床常見的進(jìn)展期肝病，常由多種基礎(chǔ)肝病如病毒性肝炎、脂肪性肝病、酒精性肝病、膽汁淤積性肝炎等慢性疾病發(fā)展而來。每年全球有超過100 萬人死于重度肝纖維化，其中約11%的患者來自中國［2］。在臨床工作中，他汀類藥物常用于脂肪肝的治療。然而，近年來多項研究揭示他汀類藥物在肝臟中具有緩解肝內(nèi)脂肪堆積之外的保護(hù)作用［3］。Schierwagen 等［4］證實，他汀類藥物可通過抑制GTP 蛋白酶RhoA 及Ras 蛋白異戊二烯化緩解非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）導(dǎo)致的肝內(nèi)炎癥。此外，他汀類藥物在多種動物模型中具有緩解纖維化形成、保護(hù)肝臟功能的作用。既往研究［5］表明，在嚴(yán)重NASH 導(dǎo)致的肝纖維化中，他汀類可抑制肝細(xì)胞對星狀細(xì)胞的旁分泌，以及星狀細(xì)胞的激活。在膽源性肝纖維化中，他汀類藥物可激活孕烷X 受體（pregnane X receptor，PXR）及過氧化物酶體增殖物激活受體α （perixisome proliferation-activated receptor α，PPARα）通路，降低肝內(nèi)膽汁酸濃度［6］。在本研究中，首先通過meta 分析探討他汀類藥物在多種慢性肝病中是否可緩解肝纖維化進(jìn)展及門脈高壓癥；再通過腹腔注射四氯化碳（CCl4）構(gòu)建小鼠肝纖維化模型，進(jìn)一步明確他汀類藥物在肝纖維化這一嚴(yán)重肝臟病變中的作用和機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 檢索策略

檢索PubMed 上相關(guān)文獻(xiàn)，起止時間為2010 年1 月—2020 年6 月。 檢索策略為（statin OR statins OR simvastatin OR pravastatin OR lovastatin OR atorvastatin OR fluindostatin OR rosuvastatin） AND （liver diseases OR hepatitis B OR hepatitis C OR alcoholic liver disease OR fatty liver OR liver cancer OR hepatocellular carcinoma OR HCC）。

1.2 文獻(xiàn)的納入和排除

文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)：英文語言；存在使用他汀類藥物與不使用他汀類藥物的組間比較；患者存在明確基礎(chǔ)肝?。换颊呔哂忻鞔_肝功能失代償及肝纖維化；其他并發(fā)癥如靜脈曲張、腹水、肝性腦病等有明確定義；隊列中患者年齡均>18 周歲。文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn)：基礎(chǔ)研究；病例分析；綜述；實驗設(shè)計存在明顯缺陷；臨床數(shù)據(jù)缺失。

所有文獻(xiàn)的納入和排除分別由2 位研究者獨(dú)立完成。當(dāng)兩人意見不一時，則由第三位研究者協(xié)調(diào)直至達(dá)成一致意見。

1.3 實驗材料

1.3.1 實驗動物 健康的雄性SPF 級C57BL/6 小鼠共16只，周齡8 周，體質(zhì)量為20～25 g，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物科學(xué)部提供。實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬） 2018-0007，使用許可證號為SYXK（滬） 2018-0027。動物飼養(yǎng)于12 h 循環(huán)光照/黑暗、恒溫、恒濕的環(huán)境下，提供標(biāo)準(zhǔn)飼料及飲水。本研究中動物實驗經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)［2020動倫審第（102）號］。

1.3.2 主要試劑與儀器 阿托伐他?。ê贾蓐祸紊锟萍脊煞萦邢薰?，中國），CCl4、TRIzol 試劑（Sigma-Aldrich，美國），反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、高保真DNA聚合酶（Invitrogen，美國），氯仿、異丙醇、無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國），DEPC 水、甘油醛-3-磷酸脫 氫 酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（上海翊圣生物科技有限公司，中國），反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR 試劑盒（TaKaRa，日本），聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchonininc acid，BCA）蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國），蛋白裂解液（ThermoFisher，美國），collagen Ⅰ抗體、Smad4 抗體（Abcam，英國），辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗（Jackson ImmunoResearch，美國），ECL 發(fā)光試劑盒（ThermoFisher，美國）。

主要實驗儀器包括高速離心機(jī)（Eppendorf，德國）、紫外分光光度計（ThermoFisher，美國）、實時熒光定量PCR 儀（Roche，瑞士）、Odyssey 紅外熒光掃描儀（LICOR，美國）。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠肝纖維化模型的建立及分組 將16 只小鼠隨機(jī)分為對照組、阿托伐他汀組、 CCl4注射組、CCl4注射聯(lián)合阿托伐他汀組，每組4只。CCl4注射組小鼠以20%體積分?jǐn)?shù)的CCl4按1 mL/kg 的劑量，每周行2 次腹腔注射；對照組使用同劑量玉米油進(jìn)行腹腔注射；阿托伐他汀組小鼠每日以15 mg/kg劑量的阿托伐他汀灌胃1次；CCl4注射聯(lián)合阿托伐他汀組聯(lián)合采用上述CCl4和阿托伐他汀的處理方式。

動物每周固定時間稱重。飼養(yǎng)4周后對所有小鼠進(jìn)行安樂死處理，記錄體質(zhì)量后開腹游離腹腔大血管和肝臟。從下腔靜脈抽取血液約1.5 mL，12 000×g離心5 min，獲得的血清于-80 ℃冰凍保存。離斷相關(guān)韌帶及血管，完整取出小鼠肝臟。將肝臟按肝葉解剖切成小片，分別置于4%多聚甲醛（制備石蠟切片）及凍存管（-80 ℃超低溫冰箱）中，以備后續(xù)使用。檢測小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）濃度。

1.4.2 天狼星紅染色觀察肝組織纖維化 將小鼠肝臟制備石蠟切片，厚度為4 μm，二甲苯脫蠟至水洗；將切片置0.1%天狼星紅染液中1 h 后，蒸餾水洗滌2 次（每次4 min）；將Harris's 蘇木素染料滴于切片上，于37 ℃孵育20 min，蒸餾水洗滌2 次（每次4 min）；使用95%、70%的乙醇脫水，二甲苯通透5 min 后，中性樹膠封片；使用顯微鏡觀察、拍照。

1.4.3 免疫熒光染色觀察collagenⅠA 的表達(dá) 取小鼠肝臟切片，磷酸鹽緩沖液洗滌10 min，重復(fù)2 次；5%胎牛血清室溫封閉1 h 后，使用0.2%Triton X-100 通透10 min；隨后加入抗collagen ⅠA 的一抗，4 ℃孵育過夜；次日，磷酸鹽緩沖液清洗，重復(fù)2次；熒光二抗室溫孵育1 h，使用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）室溫染細(xì)胞核10 min；于倒置熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.4.4 實時定量PCR TRIzol 法提取小鼠肝組織RNA；將小塊肝組織在1 mL 的TRIzol 中勻漿，隨后加入0.2 mL氯仿使蛋白與RNA分離；待分層后吸取含RNA的水相部分，與0.5 mL 異丙醇充分混勻使RNA 沉淀；以75%乙醇洗滌3 次后干燥，得到肝組織RNA，并利用紫外分光光度計進(jìn)行濃度和純度測定。

以所獲樣本的RNA 添加反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，得到cDNA。利用Syber Green 試劑盒及目標(biāo)基因序列引物進(jìn)行實時定量PCR，檢測肝組織α平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ，以及白介素（interleukin，IL）-1b、IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）的表達(dá)。

1.4.5 免疫印跡法檢測肝組織α-SMA 蛋白和磷酸化Smad4 的表達(dá) 將小塊肝臟組織在預(yù)先配制好的含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液中碾磨，直至云霧狀后于冰上放置30 min；隨后，11 000×g高速離心并吸取上清；最后，采用BCA 法測定小鼠肝臟組織的蛋白濃度。蛋白質(zhì)加熱變性后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，隨后以濕轉(zhuǎn)法將蛋白由凝膠上轉(zhuǎn)印至PVDF膜上；5%脫脂牛奶封閉1 h后加入稀釋后的抗α-SMA 抗體（1∶1 000）、抗pSmad4 抗體（1∶1000）或抗GAPDH抗體（1∶2 000），4 ℃振蕩孵育過夜；TBST 洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，再次用TBST 洗膜；最后以ECL 法將膜上蛋白顯色，經(jīng)顯影處理后，采用凝膠成像分析系統(tǒng)對膠片進(jìn)行拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用逆方差加權(quán)評估入組研究的異質(zhì)性，若I2>50%則認(rèn)為不同研究間存在異質(zhì)性。采用Stata software 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。相對危險度（RR）和各研究的權(quán)重均在結(jié)果中顯示。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)比較應(yīng)用Studentt檢驗及χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)篩選及數(shù)據(jù)提取

通過初步檢索，篩選了2 705 篇英文文獻(xiàn)。經(jīng)過閱讀題目及摘要初篩后，排除不達(dá)標(biāo)的2 469 篇文獻(xiàn)，剩余236篇文獻(xiàn)。精讀文獻(xiàn)全文后，根據(jù)設(shè)定的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，排除了48篇文獻(xiàn)，剩余188篇文獻(xiàn)。經(jīng)過2名研究者反復(fù)評估，最終選取9篇文獻(xiàn)［7-15］，見圖1、表1。

表1 納入文獻(xiàn)的相關(guān)數(shù)據(jù)Tab 1 Associated data of the selected literatures

圖1 文獻(xiàn)篩選流程Fig 1 Flow chart of literature inclusion

2.2 文獻(xiàn)統(tǒng)計結(jié)果分析

2.2.1 肝纖維化進(jìn)展風(fēng)險 納入4 篇文獻(xiàn)［9-10，12，14］，共106 947例患者，其中試驗組38 770例，對照組68 177例。分析結(jié)果顯示RR=0.32，95%CI為0.31～0.33（圖2）。與對照組比較，他汀類藥物組能顯著降低肝纖維化發(fā)生率；但異質(zhì)性檢驗結(jié)果顯示I2=0.989，P<0.01，表明納入的文獻(xiàn)具有較強(qiáng)異質(zhì)性。

圖2 他汀類藥物對于肝纖維化發(fā)生風(fēng)險的影響Fig 2 Effect of statins on the risk of hepatic fibrosis

2.2.2 肝功能失代償風(fēng)險 納入4 篇文獻(xiàn)［7，12-13，15］，共17 374 例患者，其中試驗組7 973 例，對照組9 401 例。分析結(jié)果顯示RR=0.53，95%CI為0.46～0.62（圖3）。異質(zhì)性檢驗結(jié)果顯示I2=0.357，P=0.169，表明納入的文獻(xiàn)同質(zhì)性較好。與對照組比較，他汀類藥物能顯著減緩肝硬化患者肝功能失代償?shù)倪M(jìn)展。

圖3 他汀類藥物對于肝功能失代償風(fēng)險的影響Fig 3 Effect of statins on the risk of liver decompensation

2.2.3 總體死亡率 納入5篇文獻(xiàn)［7-8，11，13，15］，共59 329例患者，其中試驗組3 600 例，對照組55 729 例。分析結(jié)果顯示RR=0.55，95%CI為0.48～0.63（圖4）。異質(zhì)性檢驗結(jié)果顯示I2=0.156，P=0.311，表明納入的文獻(xiàn)同質(zhì)性較好。與對照組比較，他汀類藥物組患者總體死亡率顯著降低。

圖4 他汀類藥物對于總體死亡風(fēng)險的影響Fig 4 Effect of statins on the overall risk of death

2.3 阿托伐他汀對小鼠體質(zhì)量及肝臟損傷的影響

4周處理后，與對照組比較，CCl4注射組和CCl4注射聯(lián)合阿托伐他汀組小鼠體質(zhì)量均顯著下降（均P=0.000）；而CCl4注射聯(lián)合阿托伐他汀組小鼠體質(zhì)量與CCl4注射組比較，下降程度較輕，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.040），見圖5A。與對照組比較，CCl4注射組和CCl4注射聯(lián)合阿托伐他汀組小鼠GPT、GOT 濃度均顯著上升（均P=0.000）；而CCl4注射聯(lián)合阿托伐他汀組小鼠與CCl4注射組比較，GPT、GOT 上升程度均較小，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P=0.020），見圖5B、C。

圖5 阿托伐他汀對CCl4注射導(dǎo)致的小鼠肝臟損傷及體質(zhì)量的影響Fig 5 Effect of atorvastatin on liver injury and weight of mice caused by CCl4 injection

2.4 阿托伐他汀對小鼠肝纖維化的影響

天狼星紅染色結(jié)果顯示，CCl4 注射組肝內(nèi)纖維過度沉積，以小葉中央?yún)^(qū)為主（圖6A）；而CCl4 注射聯(lián)合阿托伐他汀組小鼠中肝臟纖維化情況有所緩解。免疫熒光染色結(jié)果同樣顯示，collagen ⅠA 在CCl4 注射組高表達(dá)（圖6B）。

進(jìn)一步通過實時熒光定量PCR、免疫印跡法檢測纖維化相關(guān)標(biāo)志物α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：與對照組比較，CCl4注射組中α-SMA蛋白表達(dá)升高，α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ的mRNA 表達(dá)升高（均P<0.05）；而CCl4注射聯(lián)合阿托伐他汀組與CCl4注射組比較，上述指標(biāo)均有所下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），見圖6C～F。

圖6 阿托伐他汀對CCl4注射導(dǎo)致的小鼠肝纖維化的緩解作用Fig 6 Mitogenic effect of atorvastatin on hepatic fibrosis in the mice after CCl4 injection

2.5 阿托伐他汀對肝內(nèi)炎癥因子表達(dá)及TGF-β 通路的影響

實時熒光定量PCR 檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，CCl4注射組中IL-1b、IL-6的mRNA 表達(dá)輕微上升，TGFβ的mRNA 表達(dá)顯著升高（均P<0.05）；而CCl4注射聯(lián)合阿托伐他汀組與CCl4注射組比較，IL-1b、IL-6的mRNA表達(dá)顯著升高，TGF-β的mRNA 表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），見圖7A～C。免疫印跡法檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，CCl4注射組pSmad4 蛋白表達(dá)升高；而CCl4注射聯(lián)合阿托伐他汀組與CCl4注射組相比，pSmad4蛋白表達(dá)較低（圖7D）。

圖7 阿托伐他汀對肝內(nèi)炎癥因子表達(dá)及TGF-β通路的影響Fig 7 Effect of atorvastatin on expressions of intrahepatic inflammatory factors and TGF-β pathway

3 討論

肝纖維化是肝細(xì)胞被反復(fù)破壞后再生，膠原、糖蛋白、蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)在肝內(nèi)過度沉積并異常分布形成的病理變化。在肝病慢性病程中，肝纖維化往往由早期病變?nèi)缰靖?、肝炎發(fā)展而來。全球范圍內(nèi)，肝纖維化發(fā)生率居全球致死疾病第11 位［16］。重度肝纖維化患者因肝功能嚴(yán)重受損、生活質(zhì)量低下，生存率很低。目前，藥物治療雖然可延緩疾病發(fā)展進(jìn)程，但是對于已形成肝纖維化的肝組織缺乏保護(hù)作用；而作為現(xiàn)階段根治性手術(shù)方案的肝移植等，也只能滿足少量患者的治療需求。

他汀類藥物的主要作用是減少膽固醇和低密度脂蛋白合成，目前已作為一線治療及預(yù)防用藥在心血管疾病中得到大量應(yīng)用。該類藥物在調(diào)整血脂的同時，可有效改善局部脂肪肝癥狀。此外，既往研究［17-18］已經(jīng)揭示，他汀類具有包括抗炎、抗增殖、抗氧化、抗纖維化在內(nèi)的多重藥理作用。在本研究的meta 分析中，通過對9 篇入選文獻(xiàn)的研究，同樣發(fā)現(xiàn)他汀類藥物對不同病因?qū)е碌母卫w維化均具有保護(hù)作用。基于meta 分析的結(jié)果，本研究構(gòu)建了肝纖維化小鼠模型并予以阿托伐他汀治療。通過組織染色、實時熒光定量PCR、免疫印跡法等方法，檢測肝纖維化標(biāo)志物α-SMA 及膠原蛋白的分布和表達(dá)，驗證了他汀類藥物對肝纖維化的保護(hù)作用。

肝纖維化是肝內(nèi)多種細(xì)胞、生物因子和信號通路長期協(xié)同作用形成的復(fù)雜的病理性改變。目前認(rèn)為，多種病因?qū)е碌母蝺?nèi)炎癥激活肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝纖維化的經(jīng)典機(jī)制，其中TGF-β 通路的激活是其中的重要環(huán)節(jié)［19］。本研究通過實時熒光定量PCR、免疫印跡法等方法，檢測IL-1b、IL-6、TGF-β的mRNA 表達(dá)以及pSmad4 蛋白的表達(dá)量，提示他汀類藥物可能通過調(diào)控TGF-β 通路，延緩肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展。有研究者已嘗試?yán)盟☆愃幬锏淖饔脵C(jī)制，使肝臟疾病患者在臨床治療中獲益。Huang等［12］及Simon 等［9］分別證實，使用他汀類藥物可顯著降低乙型和丙型病毒性肝炎患者的肝硬化發(fā)病率，且藥物用量與肝硬化風(fēng)險之間存在劑量-效應(yīng)關(guān)系；其他不良事件如肝功能失代償、腹水、死亡的發(fā)生率均在使用他汀類藥物后下降。Trebicka 等［20］在動物模型中發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀通過抑制RhoA/Rho 激酶信號，激活一氧化氮合酶，促進(jìn)一氧化氮的釋放，并最終舒張肝內(nèi)血管，降低肝硬化導(dǎo)致的門脈高壓。Pollo-Flores 等［21］在臨床研究中證實，使用辛伐他汀后門脈高壓患者肝靜脈壓力梯度平均降低20%以上。肝細(xì)胞癌是最常見的終末期肝病。Zhou 等［22］在一項meta 分析中發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀及氟伐他汀可顯著降低肝癌發(fā)生風(fēng)險。Wu 等［23］則發(fā)現(xiàn)，使用他汀類聯(lián)合非手術(shù)治療，可提高晚期肝癌患者的總體存活率。

綜上所述，他汀類這一臨床常用藥物具有諸多獨(dú)立于調(diào)節(jié)脂肪代謝的藥理機(jī)制，在肝臟疾病的臨床治療中具有廣闊的應(yīng)用前景；但需要進(jìn)一步明確藥物在不同肝臟疾病中的具體作用機(jī)制，并在大規(guī)模前瞻性臨床研究中加以證實，為包括肝硬化在內(nèi)的多種肝臟疾病的治療提供思路。