陳吉聰，鄧 艷，肖洪賀，李婉嫕，李 妍，楊靜嫻

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是中老年人常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以進(jìn)行性記憶力減退和認(rèn)知功能障礙為主要表現(xiàn)[1]，其典型的病理特征為大腦皮層和海馬區(qū)出現(xiàn)老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元丟失。由于缺乏有效的治療藥物，AD 已成為嚴(yán)重威脅人類晚年健康的主要疾病之一[2]。目前國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有藥物雖能部分緩解AD 癥狀，但都無(wú)法修復(fù)腦內(nèi)大量丟失的神經(jīng)元，且存在一定的不良反應(yīng)[3]。因此，尋找并建立能促進(jìn)腦內(nèi)神經(jīng)再生、補(bǔ)充替代缺失神經(jīng)元的新方法對(duì)治療AD 具有重要意義。

神經(jīng)干細(xì)胞（Neural stem cells，NSCs）是存在于神經(jīng)系統(tǒng)中具有自我更新和多向分化潛能的一類細(xì)胞，在特定條件下能分化成神經(jīng)系統(tǒng)的各類細(xì)胞，再生替代缺損的神經(jīng)組織，重建神經(jīng)功能。NSCs 的增殖、分化與遷移等行為高度依賴其生長(zhǎng)的微環(huán)境，即神經(jīng)干細(xì)胞巢。AD 腦內(nèi)的病理?yè)p傷改變了神經(jīng)干細(xì)胞巢，妨礙了NSCs 生物學(xué)功能的發(fā)揮，使基于原位激活內(nèi)源性NSCs 的神經(jīng)發(fā)生和基于外源性NSCs移植的治療策略，都無(wú)法實(shí)現(xiàn)有效神經(jīng)再生[4]。

酸棗仁皂苷A（JuA）是中藥酸棗仁的主要活性成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，JuA 除具有鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、抗抑郁等作用外[5]，還能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化引起的炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)AD 模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力[6-7]。雖然JuA 的抗AD 作用逐漸受到關(guān)注，但尚無(wú)其促進(jìn)神經(jīng)再生的有關(guān)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建APP-NSCs 細(xì)胞模型，進(jìn)一步探究JuA 對(duì)APPNSCs 增殖與分化的影響，為其用于治療AD 提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 酸棗仁皂苷A（批號(hào)：wkq19090304，四川省維克奇生物科技有限公司）；胎牛血清（批號(hào)：19110505，浙江天杭生物科技股份有限公司）；青-鏈雙抗（批號(hào)：J190007，美國(guó)Hyclone 公司）；B27（批號(hào)：175040010，美國(guó)Gibco 公司）；質(zhì)粒提試劑盒（美國(guó)Omega 公司）；EGF、bFGF8 均購(gòu)于美國(guó)PeproTech 公司；Nestin、SOX2、GFAP、NF-M、NG2 一抗均購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗小鼠CyTM 3 標(biāo)記二抗、驢抗小鼠FITC 標(biāo)記二抗均購(gòu)于美國(guó)Jackson 公司；CCK8、LDH試劑盒均購(gòu)于沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司。

1.1.2 儀器 Ti-S 型倒置熒光顯微鏡（日本尼康株式會(huì)社）；C00I01HW 型CO2培養(yǎng)箱（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；MR-96A 型酶標(biāo)儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；MG96G 型PCR 儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）；SH-510 型凝膠成像系統(tǒng)（杭州申花科技有限公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)C57BL/6 健康小鼠購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（遼）:2013-0001。研究中所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)操作都經(jīng)過(guò)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)并嚴(yán)格按照國(guó)際實(shí)驗(yàn)室倫理行為準(zhǔn)則實(shí)施。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 NSCs 的分離培養(yǎng)與鑒定 從乳鼠海馬組織中分離NSCs，以5×106個(gè)/mL 的密度置于加入增殖培養(yǎng)基（含20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、2%B27、1% P/S 的DMEM-F12）的24 孔板中培養(yǎng)。3 d半量換液，10 d 左右開(kāi)始傳代。免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)NSCs 標(biāo)志性蛋白Nestin 和Sox2 表達(dá)。

1.2.2 APP-NSCs 模型的構(gòu)建 APP-NSCs 模型按本實(shí)驗(yàn)室前期已報(bào)道的方法建立[8]，取GFP 或GFPAPP 質(zhì)粒15 μg、pLP1 質(zhì)粒6.5 μg、pLP2 質(zhì)粒2.5 μg、pLP/VSV-G 質(zhì)粒3.5 μg，采用脂質(zhì)體2000 介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，空白對(duì)照組轉(zhuǎn)染GFP 質(zhì)粒。培養(yǎng)24 h 后，熒光顯微鏡下觀察，呈綠色熒光，收集病毒液并轉(zhuǎn)染NSCs。72 h 后采用RT-PCR 法和Western blot 檢測(cè)APP mRNA 以及蛋白的表達(dá)。

1.2.3 JuA 最佳藥物濃度的篩選 取P3 代APPNSCs 以5×104個(gè)/孔的密度鋪96 孔板，分別添加6.25、12.5、25、50、100 μmol/L JuA 培養(yǎng)，以正常培養(yǎng)的APP-NSCs 為對(duì)照，48 h 后每孔加入10 μL CCK8 試劑，37 ℃避光孵育1 h，最后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450值并計(jì)算細(xì)胞增殖率。檢測(cè)LDH 時(shí)，鋪板、分組、給藥培養(yǎng)同上，48 h 后取每孔的培養(yǎng)上清液按說(shuō)明書操作，最后檢測(cè)A450值并計(jì)算LDH 釋放量。

1.2.4 JuA 對(duì)APP-NSCs 增殖能力的影響 實(shí)驗(yàn)共分4 組，分別為NSCs 組、NSCs-JuA 組、APPNSCs 組、APP-NSCs-JuA 組。取NSCs、APP-NSCs按上述分組以1×106個(gè)/mL 的密度鋪24 孔板并置于增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，7 d 后鏡下隨機(jī)視野拍照，每組5 張，根據(jù)標(biāo)尺計(jì)算神經(jīng)球直徑。另取NSCs、APPNSCs 按上述分組以5×106個(gè)/孔的密度鋪96 孔板，于增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。48 h 后每孔添加終濃度為20 μmol/L 的BrdU，12 h 后棄去，PBS 清洗，加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS 清洗，隨后使用0.1%Triton×100 處理15 min，PBS 清洗后用2 mol/L HCl置于37 ℃下處理30 min，接著用0.1 mol/L，pH = 8.5的硼酸緩沖液中和10 min，PBS 清洗，使用5% BSA室溫封閉30 min，棄去液體，孵育一抗，4℃過(guò)夜。棄去液體，PBS 清洗，加入二抗，室溫孵育1h，PBS 清洗，DAPI 室溫染核5 min，最后鏡下隨機(jī)視野拍照，每組5 張。

1.2.5 JuA 對(duì)APP-NSCs 分化能力的影響 按“1.2.4”項(xiàng)下分組將NSCs、APP-NSCs 以1×106個(gè)/mL的密度鋪24 孔板，置于分化培養(yǎng)基（含10% FBS、1% P/S 的DMEM-F12）中培養(yǎng)，10 d 后使用免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)各組向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞分化率。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 NSCs 的鑒定與APP-NSCs 模型的構(gòu)建

NSCs 的鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1，通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NSCs 表達(dá)Nestin 和Sox2 雙陽(yáng)性，證明分離提取的細(xì)胞為未分化的NSCs。APP-NSCs 的構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖2。鏡下可見(jiàn)APP-NSCs 表達(dá)GFP 綠色熒光，證明轉(zhuǎn)染成功，見(jiàn)圖3。Western blot 及RT-PCR 結(jié)果見(jiàn)圖4，與GFP-NSCs 組相比，APP-NSCs 組的Aβ1-42蛋白及APP mRNA 的表達(dá)量上升，結(jié)果證明APP-NSCs 模型制備成功。

圖1 NSCs 的鑒定Fig. 1 Identification of NSCs

圖2 APP-NSCs 的構(gòu)建Fig. 2 Construction of APP-NSCs

圖3 APP-NSCs 的鑒定Fig. 3 Identification of APP-NSCs

圖4 Western blot 條帶圖與RT-PCR 條帶圖Fig. 4 Western blot strip plot and RT-PCR strip plot

2.2 JuA對(duì)APP-NSCs細(xì)胞活性和LDH釋放量的影響

與對(duì)照組相比，25、50、100 μmol/L JuA 組的細(xì)胞增殖率上升（P＜0.05），LDH 釋放量下降（P＜0.05）。 結(jié)果表明，25、50、100 μmol/L JuA 均對(duì)APP-NSCs 具有一定的保護(hù)作用，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇25 μmol/L 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)給藥劑量，見(jiàn)圖5。

圖5 JuA 對(duì)APP-NSCs 細(xì)胞增殖率和LDH 釋放量的影響（n = 6）Fig. 5 Effects of JuA on cellular activity and LDH release from APP-NSCs（n = 6）

2.3 JuA 對(duì)APP-NSCs 增殖能力的影響

與NSCs 組相比，NSCs-JuA 組神經(jīng)球直徑增大（P＜0.05），APP-NSCs 組神經(jīng)球直徑減?。≒＜0.01）；與APP-NSCs 組相比，APP-NSCs-JuA 組神經(jīng)球直徑增大（P＜0.01），見(jiàn)圖6、圖7。

圖6 JuA 對(duì)神經(jīng)球直徑的影響Fig. 6 Effects of JuA on the neurosphere diameter

圖7 JuA 對(duì)神經(jīng)球直徑影響的統(tǒng)計(jì)圖（n = 5）Fig. 7 Statistical plot of the effects of JuA on neurosphere diameter （n = 5）

與NSCs 組相比，NSCs-JuA 組的BrdU+陽(yáng)性率上升（P＜0.05），APP-NSCs 組的BrdU+陽(yáng)性率降低（P＜0.01）；而相較于APP-NSCs 組，APP-NSCs-JuA 組BrdU+陽(yáng)性率上升（P＜0.01），BrdU+結(jié)果見(jiàn)圖8、圖9。

圖8 JuA 對(duì)BrdU+陽(yáng)性率的影響Fig. 8 Effects of JuA on the percentage of BrdU+

圖9 JuA 對(duì)BrdU+陽(yáng)性影響的統(tǒng)計(jì)圖（n = 5）Fig. 9 Statistical plot of the effects of JuA on the percentage of BrdU+（n = 5）

2.4 JuA 對(duì)APP-NSCs 分化能力的影響

與NSCs 組相比，NSCs-JuA 組向神經(jīng)元（NFM）分化的比率上升 （P＜0.05），向星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP）分化的比率下降（P＜0.05），APP-NSCs組向神經(jīng)元分化的比率降低（P＜0.01），向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的比率上升（P＜0.01）；而APP-NSCs經(jīng)過(guò)JuA 治療后，與APP-NSCs 組相比，向神經(jīng)元分化的比率上升（P＜0.05），向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的比率下降（P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)圖10、圖11。

圖10 JuA 對(duì)分化的影響Fig. 10 Effects of JuA on the differentiation

圖11 JuA 對(duì)分化影響的統(tǒng)計(jì)圖（n = 5）Fig. 11 Statistical plot of the effects of JuA on the differentiation（n = 5）

3 討論

由于目前AD 的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡述清楚，使得AD 體外細(xì)胞模型的構(gòu)建呈現(xiàn)多樣性。通常采用β-淀粉樣蛋白、谷氨酸、過(guò)氧化氫、岡田酸等誘導(dǎo)SH-SY5Y 和PC12 細(xì)胞建立AD 細(xì)胞模型，揭示AD細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷、Tau 蛋白磷酸化等機(jī)制[9]。而本研究采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，即采用APP595/596 基因轉(zhuǎn)染NSCs 的方法構(gòu)建AD 細(xì)胞模型，其優(yōu)勢(shì)在于可以持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)Aβ，更好地模擬了腦內(nèi)的微環(huán)境，一定程度上提高了病理表達(dá)的準(zhǔn)確性。通過(guò)Western Blot 及RT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后NSCs，發(fā)現(xiàn)其胞內(nèi)高表達(dá)APP 基因和致病Aβ1-42蛋白，由此證明APP-NSCs 模型構(gòu)建成功。

NSCs 的增殖和分化對(duì)于維持大腦正常的認(rèn)知和情感功能至關(guān)重要，但是隨著年齡的增長(zhǎng)大腦中神經(jīng)再生逐漸衰減，而AD 患者腦內(nèi)神經(jīng)再生明顯低于同齡水平，激活神經(jīng)再生為AD 的治療提供了新的策略。文獻(xiàn)報(bào)道顯示JuA 能有效抑制脂多糖誘導(dǎo)的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[6]，還可改善Aβ42誘導(dǎo)的小鼠認(rèn)知功能障礙和腦組織損傷[9]，說(shuō)明JuA 具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，JuA 能提升APP-NSCs 的存活率并降低其LDH 的釋放量，并恢復(fù)APP-NSCs 的增殖能力和向神經(jīng)元分化的能力，說(shuō)明JuA 能夠減輕過(guò)表達(dá)APP 引起的NSCs 增殖和分化功能損傷，有望改善AD 癥狀，但JuA 能否激活A(yù)D 模型小鼠海馬神經(jīng)再生以及具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究以APP-NSCs 為體外細(xì)胞模型，從細(xì)胞增殖、分化方面探討JuA 對(duì)AD 細(xì)胞模型的影響，研究證實(shí)JuA 可提高APP-NSCs 的增殖能力，并促進(jìn)其向神經(jīng)元分化。但作為體外實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能具有一定的局限性，JuA 促進(jìn)神經(jīng)再生的作用有待通過(guò)動(dòng)物模型進(jìn)一步驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)從神經(jīng)再生角度出發(fā)，為JuA 用于AD 的潛在應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。