黃瓊林

（廣東醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 湛江 524023）

中藥高良姜來源于姜科多年生草本植物高良姜Alpinia officinarumHance 的干燥根莖[1]，是我國傳統(tǒng)藥食兩用大宗藥材。高良姜具有溫胃止嘔、散寒止痛等功效，可用于治療脘腹冷痛、胃寒嘔吐、噯氣吞酸等癥。 資源調(diào)查發(fā)現(xiàn)，高良姜野生資源已經(jīng)基本滅絕，人工栽培高良姜也在逐年明顯下降，不少地區(qū)已出現(xiàn)高良姜藥材供不應(yīng)求的態(tài)勢(shì)，不能滿足臨床和民俗需要[2-3]。

黃酮是高良姜的主要成分和藥效物質(zhì)之一。高良姜含有高良姜素、高良姜酚、山柰素、山柰酚、槲皮素和異鼠李素等黃酮類化合物，這些化合物具有抗氧化、降尿酸、抗炎鎮(zhèn)痛、抗癌等藥理活性[4-5]。鑒于高良姜的藥理活性成分比較清楚，通過基因工程調(diào)控黃酮類生物合成途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)，促進(jìn)高良姜藥效成分的合成和提高高良姜藥用質(zhì)量，是緩解高良姜當(dāng)前資源不足的方法之一。

苯丙烷代謝途徑是黃酮類化合物生物合成的上游途徑，苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）則是該途徑的第一個(gè)關(guān)鍵限速酶，催化L-苯丙氨酸產(chǎn)生反式肉桂酸，再經(jīng)香豆酸、芥子酸等中間產(chǎn)物及相應(yīng)的催化酶的作用下，分別生成黃酮、木質(zhì)素和酚類等代謝產(chǎn)物[6]。此外，PAL 也是植物初級(jí)代謝和次生代謝的關(guān)鍵連接點(diǎn)，對(duì)植物生長發(fā)育、花色形成、抗病抗逆等生理過程具有重要的調(diào)控作用[7]。目前，PAL基因已從膜莢黃芪[8]、華細(xì)辛[9]、枸杞[10]等中藥材中獲得克隆，而高良姜的黃酮生物合成相關(guān)酶基因研究的報(bào)道仍較少。

本研究擬基于高良姜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，挖掘高良姜PAL基因cDNA 序列，探討其序列特征以及在高良姜不同組織中的表達(dá)差異，為今后高良姜PAL基因的功能鑒定和表達(dá)調(diào)控建立研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 基因序列

在前期研究中，作者以產(chǎn)自道地產(chǎn)區(qū)——廣東省徐聞縣的高良姜為材料，采用因美納NovaSeq 6000 平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序，并通過序列組裝獲得147 652 條非重復(fù)序列基因[11]。本研究在此基礎(chǔ)上，通過序列比對(duì)檢索和注釋高良姜PAL基因并確定其序列。

1.2 主要試劑

RNA prep Pure Plant Kit 試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；GoScript Reverse Transcription System 和GoTaq qPCR Master Mix 試劑盒均購自美國普洛麥格生物技術(shù)有限公司。

1.3 基因序列分析

采用Omiga 2.0 對(duì)高良姜PAL基因序列進(jìn)行編碼區(qū)及開放閱讀框（Open reading frame，ORF）檢索，并將其翻譯成蛋白質(zhì)序列。利用Protparam 和Protscale 軟件分析基因序列的組成和親/疏水性等理化特征。使用Conserved Domains 數(shù)據(jù)庫分析編碼蛋白質(zhì)的保守功能域，利用Target 1.1 和TMHMM 軟件完成編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽、信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)分析。采用SOPMA 軟件分析編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。運(yùn)用ClustalX 和MEGA 軟件完成編碼蛋白質(zhì)的多重序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.4 基因表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）檢測(cè)高良姜PAL基因在不同組織樣品中的表達(dá)差異。分別以新鮮高良姜的根莖、莖和葉為材料，使用RNA prep Pure Plant Kit 提取總RNA，再用GoScript Reverse Transcription System 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

根據(jù)檢索所得的高良姜PAL基因序列，設(shè)計(jì)用于qPCR 的特異性引物，其中，上游引物的序列為：5'-CTTCAGGGCTACTCAGGCAT-3'；下游引物序列為：5'-GTAGGACAGGGGAACGAGG-3'。 參照GoTaq qPCR Master Mix 試劑盒的說明書，qPCR 反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中，2 × qPCR Master Mix 10 μL，10 μM 上、下游引物各0.3 μL，cDNA 模板適量，并用滅菌蒸餾水補(bǔ)足體積。qPCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40 個(gè)循環(huán)。以β-tubulin 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt計(jì)算高良姜PAL基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果和分析

2.1 基因序列檢索

通過在高良姜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中檢索，獲得一條注釋為PAL基因的cDNA 序列，并將其命名為AoPAL。AoPAL序列長度為2 261 bp，其中含有2 130 bp編碼區(qū)、44 bp 5'端非編碼區(qū)和84 bp 3'端非編碼區(qū)。AoPAL編碼區(qū)包含2 130 個(gè)堿基，GC 含量為64.2%，編碼710 個(gè)氨基酸，見圖1。

圖1 AoPAL 基因編碼區(qū)核苷酸和氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide and encoded amino acid sequence of AoPAL coding region

2.2 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

AoPAL等15 個(gè)植物來源的PAL基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，見圖2，15 個(gè)PAL基因聚類成兩大分支，其中，AoPAL與單子葉植物小果野芭蕉、玉米和鐵皮石斛等來源的PAL基因聚集為一支，而其它雙子葉植物來源的PAL基因聚成另外一支，這些PAL基因的系統(tǒng)發(fā)育聚類結(jié)果與對(duì)應(yīng)植物起源分類相符。AoPAL與源于單子葉植物的PAL基因具有較高的序列同源性和保守度，推測(cè)它們?cè)诠δ苌弦灿休^高的相似性。

圖2 15 個(gè)植物來源PAL 基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系聚類圖Fig. 2 Phylogenetic tree of PAL genes from 15 plants

2.3 編碼蛋白的功能分析

為了更好地理解AoPAL的功能，對(duì)AoPAL的編碼蛋白進(jìn)行保守功能域分析。將AoPAL編碼蛋白的氨基酸序列導(dǎo)入Conserved Domains 數(shù)據(jù)庫，保守功能域檢索結(jié)果，見圖3，編碼蛋白AoPAL 具有多位活性位點(diǎn)，包含1 個(gè)從第8 位氨基酸到第710 位氨基酸的苯丙氨解氨酶的保守功能域，歸屬于苯丙氨解氨酶超級(jí)家族。結(jié)果表明，AoPAL 具有苯丙氨解氨酶的功能，而AoPAL即為高良姜苯丙氨解氨酶的編碼基因。

圖3 AoPAL 蛋白保守功能域示意圖Fig. 3 Conserved domains of AoPAL

2.4 編碼蛋白的特征分析

編碼蛋白AoPAL 的分子量76.55 kDa，等電點(diǎn)為5.78，包含丙氨酸、亮氨酸等20 余種氨基酸。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為37.29，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。AoPAL 多肽鏈整體表現(xiàn)為親水性，沒有出現(xiàn)明顯的疏水區(qū)域，說明其屬于水溶性蛋白質(zhì)。

TMHMM 分析顯示，AoPAL 整條多肽鏈均位于細(xì)胞膜外，不含任何跨膜結(jié)構(gòu)域，說明AoPAL 在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮功能。亞定位分析也發(fā)現(xiàn)，AoPAL 不含有信號(hào)肽和轉(zhuǎn)運(yùn)肽，進(jìn)一步表明了AoPAL 在細(xì)胞質(zhì)中合成并執(zhí)行相應(yīng)的催化功能。

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，AoPAL 由407 個(gè)α-螺旋、64 個(gè)延伸鏈、44 個(gè)β-轉(zhuǎn)角和199 個(gè)隨意卷曲組成，表明其為以α-螺旋和隨意卷曲為主要元件構(gòu)成的混合結(jié)構(gòu)型蛋白質(zhì)。

2.5 基因表達(dá)分析

基于熒光定量PCR 計(jì)算的相對(duì)表達(dá)量，見圖4，AoPAL在根莖、莖中的表達(dá)水平顯著高于葉，其中，又以在根莖中的表達(dá)水平最高。

圖4 AoPAL 在高良姜不同組織的中表達(dá)分析Tab. 4 Expression difference of AoPAL in various tissue of A. officinarum

3 討論

PAL 在黃酮類、木質(zhì)素以及其它活性成分的生物合成有著重要的作用，其表達(dá)與黃酮的積累密切相關(guān)[12]。關(guān)巍等[13]發(fā)現(xiàn)PAL 活性在彩色馬鈴薯發(fā)育期間與花色苷的積累呈現(xiàn)正相關(guān)性。郭肖等[14]研究表明水芹黃酮含量與PAL 活性的變化趨勢(shì)一致，且二者相關(guān)系數(shù)極為顯著。因此，調(diào)控PAL 的表達(dá)和活性可以有效地提高黃酮類化合物的合成。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能以高通量模式挖掘無基因組參考物種的基因序列，是基因組圖譜仍屬空白的大多藥用植物進(jìn)行功能基因鑒定、活性成分的生物合成和調(diào)控機(jī)理研究的有效方法之一[15]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序獲取AoPAL的cDNA 全長和編碼區(qū)序列，相比同源克隆和 RACE 技術(shù)等傳統(tǒng)的基因挖掘方法，具有簡單、方便和高效等顯著優(yōu)勢(shì)。生物信息學(xué)分析表明，AoPAL 氨基酸序列與已報(bào)道的植物PAL 氨基酸序列同源性較高，二級(jí)結(jié)構(gòu)也與青天葵等單子葉植物相似，均是以α-螺旋和不規(guī)則卷曲為主。AoPAL 同樣包含PAL-HAL 結(jié)構(gòu)域，并歸屬苯丙氨酸解氨酶超級(jí)家族，因此說明AoPAL 是具有苯丙氨酸解氨酶活性的蛋白質(zhì)。

植物PAL基因多以基因家族形式存在，不同植物中常含有2 ～ 6 個(gè)PAL基因家族成員，這些成員在不同組織中的表達(dá)模式以及在植物次生代謝產(chǎn)物的合成和調(diào)控過程所發(fā)揮的作用也各有不同[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，AoPAL在高良姜的根莖中表達(dá)高于葉和莖兩個(gè)地上部位，這與高良姜根莖部位藥效成分含量較高并以根莖入藥的事實(shí)相符。然而，AoPAL在高良姜黃酮類生物合成上涉及的具體通路和作用還有待進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

本研究基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序挖掘到高良姜次生代謝苯丙烷代謝途徑的第一步關(guān)鍵限速酶基因AoPAL，明確了該基因的序列特征及其編碼蛋白的功能，并探討了其在高良姜不同組織中的表達(dá)模式，為高良姜黃酮類藥效成分的生物合成和基因調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。