杲 東

（南京市浦口區(qū)中醫(yī)院藥劑科 江蘇 南京 211800）

肉蓯蓉為《中國(guó)藥典》收載的中藥[1]，其干燥的肉質(zhì)鱗莖常做中藥“大蕓”入藥，被譽(yù)為“沙漠人參”[2-3]。臨床上常用黃酒炙肉蓯蓉，以增強(qiáng)其補(bǔ)腎壯陽的功效[4]。翻看2020 版《中國(guó)藥典》，發(fā)現(xiàn)對(duì)酒炙肉蓯蓉的相關(guān)描述少之又少，對(duì)其酒蒸工藝的介紹更是一帶而過。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，劉雯霞[5]采用正交試驗(yàn)研究管花肉蓯蓉的酒蒸工藝，但受限于正交試驗(yàn)方法的拘束，其對(duì)工藝的研究受限。近年來，隨著正交試驗(yàn)的改進(jìn)方法—響應(yīng)面法的流行，其本身具有精度高、效率高等特點(diǎn)[6-8]。因此，本文采用響應(yīng)面法探討其酒蒸炮制工藝，為肉蓯蓉的酒蒸工藝提供指導(dǎo)。

1.材料與儀器

肉蓯蓉購(gòu)買于安徽省亳州市康美中藥材市場(chǎng)，產(chǎn)于內(nèi)蒙古巴彥淖爾盟阿拉善旗，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)方成武教授鑒定為肉蓯蓉的干燥品。本試驗(yàn)開始于2020 年6 月，于2020 年9 月完成。對(duì)照品松果菊苷、毛蕊花糖苷（批號(hào)分別為82854-37-3、61276-17-3，成都普菲德生物技術(shù)有限公司），質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；水為純凈水，黃酒（紹興市圣御山酒業(yè)有限公司），其他試劑均為分析純。Waters Acquity 液相色譜儀，PDA 檢測(cè)器。

1.2 方法

1.2.1 含量測(cè)定 指標(biāo)成分松果菊苷、毛蕊花糖苷的測(cè)定按照2020 版《中國(guó)藥典》中的方法進(jìn)行，HPLC法按照通則0512 準(zhǔn)備。

1.2.2 線性關(guān)系考察 將松果菊苷和毛蕊花糖苷的對(duì)照品混合，分別取1、3、5、7、9 mL 于10 mL 量瓶中，剩余用50%甲醇填滿容積。吸取10 μL，按2020 版《中國(guó)藥典》中的含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。橫坐標(biāo)（X）選擇質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)（Y）為峰面積，得回歸方程分別為松果菊苷Y= 125 157X-217 30，r= 0.999 2，毛蕊花糖苷Y= 194 817X-338 61，r= 0.998 3。

1.2.3 方法學(xué)考察 （1）精密度考察。精密吸取混合對(duì)照品溶液20 μL，重復(fù)6 次進(jìn)樣，計(jì)算松果菊苷、毛蕊花糖苷的峰面積RSD 值分別為0.42%、0.27%，表明儀器精密度良好。（2）重復(fù)性試驗(yàn)。取同一份肉蓯蓉樣品6 份，測(cè)定對(duì)應(yīng)的峰面積。結(jié)果松果菊苷、毛蕊花糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均值分別為0.33%、0.61%，RSD 值分別為0.79%、2.27%，表明此方法重復(fù)性較好。（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)。吸取肉蓯蓉提取液，于0、2、4、8、12、24、48 h 測(cè)定松果菊苷、毛蕊花糖苷的峰面積，RSD 分別為0.82%、1.73%。表明48 h 內(nèi)肉蓯蓉的成分穩(wěn)定。（4）加樣回收率試驗(yàn)。取6 份1 g 已知含量的肉蓯蓉樣品，加入混合對(duì)照品溶液（松果菊苷、毛蕊花糖苷分別加2.12、3.52 mg/mL），用50%甲醇補(bǔ)足至50 mL，測(cè)得平均回收率分別為98.31%、101.39%，RSD 分別為2.17%、2.22%，加樣回收率良好。

1.2.4 樣品含量測(cè)定 按單因素變量的要求將酒蒸后的肉蓯蓉樣品分成3 份，按“2.1”項(xiàng)方法測(cè)定其對(duì)應(yīng)的峰面積，重復(fù)測(cè)定3 次，取均值計(jì)算含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理 為了降低高含量成分對(duì)低含量成分造成的掩蓋，將測(cè)定的成分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行Z-score標(biāo)準(zhǔn)化處理[9]，之后將標(biāo)準(zhǔn)化的值相加為綜合評(píng)分。標(biāo)準(zhǔn)化值=（含量-算術(shù)平均數(shù)）/標(biāo)準(zhǔn)差。

2.結(jié)果

2.1 單因素分析

將標(biāo)準(zhǔn)化處理過后數(shù)據(jù)的綜合評(píng)分作為考察指標(biāo)，考察酒蒸肉蓯蓉過程中蒸制時(shí)間、料液比、飲片厚度、黃酒度數(shù)對(duì)其有效成分含量的影響。

2.1.1 蒸制時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分的影響 根據(jù)表1 的條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每組進(jìn)行3 次重復(fù)測(cè)定，采用Z-score 標(biāo)準(zhǔn)化處理數(shù)據(jù)（表2），取3 次測(cè)量的均值作為含量，得出綜合評(píng)分。當(dāng)蒸制40 min 時(shí)，綜合評(píng)分達(dá)到最大值。當(dāng)蒸制100 min 時(shí)，綜合評(píng)分為負(fù)數(shù)。說明，有效成分含量受蒸制時(shí)間的影響較大，所以選擇40 min為最佳蒸制時(shí)間。

表1 單因素分析

表2 單因素結(jié)果

2.1.2 料液比對(duì)綜合評(píng)分的影響 根據(jù)表1 條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每組進(jìn)行3 次重復(fù)測(cè)定，采用Z-score 標(biāo)準(zhǔn)化處理數(shù)據(jù)（表2），取3 次測(cè)量均值作為含量，得出綜合評(píng)分。料液比在3 時(shí)達(dá)到最大值。推測(cè)隨著料液比的增加，有效成分能更充分地溶解在乙醇中。后續(xù)隨著料液比的增加，其含量變化不顯著。因此，最佳料液比為3。

2.1.3 飲片厚度對(duì)綜合評(píng)分的影響 根據(jù)表1 條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每組進(jìn)行3 次重復(fù)測(cè)定，采用Z-score 標(biāo)準(zhǔn)化處理數(shù)據(jù)表2，取3 次測(cè)量的均值作為含量，得出綜合評(píng)分。4 mm 為酒蒸肉蓯蓉最佳的切制厚度。一方面，酒蒸后的肉蓯蓉黏性大，切制的厚度較薄，其飲片易黏結(jié)成團(tuán)。切制較厚，不易蒸至透心。因此，選擇4 mm 為最佳切片厚度。

2.1.4 黃酒度數(shù)對(duì)綜合評(píng)分的影響 根據(jù)表1 條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每組進(jìn)行3 次重復(fù)測(cè)定，采用Z-score 標(biāo)準(zhǔn)化處理數(shù)據(jù)，見表2。取3 次測(cè)量均值作為含量，得出綜合評(píng)分。綜合評(píng)分隨黃酒的度數(shù)呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)黃酒為12%vol 時(shí)，有效成分提取最多。但考慮到乙醇易揮發(fā)，難以控制蒸制時(shí)相應(yīng)的變量。因此，不將黃酒度數(shù)作為變量進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化肉蓯蓉酒蒸工藝試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)為：3 個(gè)自變量為蒸制時(shí)間（A）、料液比（B）、飲片厚度（C），響應(yīng)值（R）為2 種指標(biāo)性成分含量的綜合評(píng)分，見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.2 模型顯著性分析 按照軟件Design-Expert 8.0.6.1 所生成的表格依次輸入對(duì)應(yīng)綜合評(píng)分的值，軟件擬合所得二次多項(xiàng)式回歸方程，輸出的二次多元回歸方程為R= 2.36 ＋0.41A-1.29B-0.28C＋0.17AB-0.49AC-0.26BC-1.38A2-2.17B2-1.42C2，決定系數(shù)（r2）=0.975 7，調(diào)整系數(shù)為0.994 4，表明根據(jù)輸出入的值所擬合得方程較好，試驗(yàn)誤差較小，此軟件建立的模型可用于松果菊苷和毛蕊花糖苷兩種成分含量的綜合評(píng)分的分析和預(yù)測(cè)。由表4 的方差分析可知，該模型極顯著（P＜0.001），失擬項(xiàng)不顯著（P= 0.742 7）。回歸方程的顯著性表明，一次項(xiàng)A、B，交互項(xiàng)AC，二次項(xiàng)A2、B2、C2有極強(qiáng)的顯著性。綜上所述，3 個(gè)自變量因素對(duì)綜合評(píng)分影響為料液比（B）＞蒸制時(shí)間（A）＞飲片厚度（C）。

表4 方差分析效果

2.2.3 肉蓯蓉酒蒸最佳工藝參數(shù)預(yù)測(cè) 由圖1 可知，響應(yīng)面的顏色和傾斜度分別反映各因素對(duì)響應(yīng)值的變化趨勢(shì)和影響程度，響應(yīng)面曲面圖顏色越深，表明其數(shù)值的變化趨勢(shì)越明顯，傾斜度越陡峭，表明其單個(gè)因素對(duì)綜合評(píng)分的影響越大[10-12]。根據(jù)Design-Expert 8.0.6.1軟件選擇綜合評(píng)分最大值為3.58 時(shí)，最優(yōu)蒸制工藝參數(shù)為蒸制時(shí)間58 min，料液比2.51，飲片厚度3.51 mm。

圖1 肉蓯蓉酒蒸工藝優(yōu)化響應(yīng)面圖

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

驗(yàn)證本試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性和真實(shí)度。為了方便實(shí)際炮制工藝的操作，將參數(shù)調(diào)整為蒸制時(shí)間58 min，料液比2.5，飲片厚度3.5 mm，重復(fù)3 次，取平均值。結(jié)果松果菊苷和毛蕊花糖苷的綜合評(píng)分為3.47，與預(yù)測(cè)值3.58相差3.07%，RSD值為1.21 說明肉蓯蓉酒蒸工藝的優(yōu)化參數(shù)切實(shí)可行，酒蒸工藝可靠，穩(wěn)定。

3.討論

在2020 版《中國(guó)藥典》中，肉蓯蓉的酒蒸炮制工藝雖有記載，但具體工藝參數(shù)未告知。因此，從中藥飲片炮制的規(guī)范性和均一性角度考慮，肉蓯蓉的酒蒸炮制工藝需得到進(jìn)一步完善。為了本試驗(yàn)工藝的嚴(yán)謹(jǐn)性，HPLC的各項(xiàng)儀器選用的檢測(cè)指標(biāo)均采用藥典指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)。黃酒中的乙醇含量隨著加熱會(huì)快速揮發(fā)，不利于控制相關(guān)變量，因此為了試驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性，將單因素試驗(yàn)中的黃酒度數(shù)這一變量刪除。

綜上所述，試驗(yàn)先對(duì)4 個(gè)單因素進(jìn)行篩選，選擇最合適的3 個(gè)因素，并確定最適當(dāng)?shù)? 個(gè)水平。分別對(duì)蒸制時(shí)間、料液比、飲片厚度3 個(gè)因素進(jìn)行考察，同時(shí)將松果菊苷和毛蕊花糖苷含量進(jìn)行Z-score 標(biāo)準(zhǔn)化處理后再相加作為綜合評(píng)分的響應(yīng)值，通過響應(yīng)面法得出最佳的工藝參數(shù)為蒸制時(shí)間58 min，料液比2.51，飲片厚度3.51 mm，并驗(yàn)證了酒蒸炮制工藝的可靠性。肉蓯蓉在此酒蒸工藝條件下進(jìn)行炮制更有利于提高其相應(yīng)的藥效成分，增加補(bǔ)腎壯陽的功效，從而為標(biāo)準(zhǔn)化肉蓯蓉炮制工藝提供一些指導(dǎo)。