張 俊，汪浩鑫，陳夢佳，閆 茜，盧嘉卡，余 慶，石德順，陸鳳花

(廣西大學 動物科學技術學院/亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530004)

顆粒細胞(granulosa cells，GCs)在卵泡發(fā)育和閉鎖過程中起至關重要作用，一方面GCs控卵泡閉鎖[1-8],另一方面GCs分泌雌激素，雌激素能促進卵泡發(fā)育和抑制GCs凋亡，卵泡的發(fā)育閉鎖與GCs狀態(tài)密切相關[9-11]。以卵泡內膜細胞分泌雄激素作為底物，在雌激素合成關鍵酶細胞色素芳香化酶(CYP19A1)作用下，同時在促卵泡素(FSH)調控下，GCs合成雌激素雌二醇促進卵泡生長[12-14]。

卵巢內雄激素主要是雄烯二酮和睪酮，在細胞色素17β羥類固醇脫氫酶(17β-HSD)作用下，雄烯二酮可轉化為睪酮。有研究報道睪酮可通過激活PI3K/AKT/FOXO3信號通路誘導小鼠原始卵泡的激活[15]。有研究指出睪酮能促進牛卵巢初級卵泡向次級卵泡的轉變，且直接通過睪酮受體發(fā)揮其調節(jié)作用[16]。也有研究表明睪酮可直接通過其受體發(fā)揮作用，通過提高間隙連接蛋白CX37表達促進小鼠卵巢發(fā)育[17]。但睪酮對水牛GCs雌激素合成的影響，目前尚未見有報道。本研究通過在水牛GCs培養(yǎng)液中添加睪酮，探討睪酮對水牛GCs雌激素合成相關基因表達和雌二醇分泌水平的影響，進而研究睪酮對水牛GCs雌激素合成能力的影響，以期從雌激素合成角度為進一步研究水牛卵泡發(fā)育雌激素分泌機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及配制睪酮(testosterone，Tes)購自Solarbio公司；DMEM和血清(FBS)購自Gibco公司；其他試劑無特別說明均購自Sigma公司。細胞培養(yǎng)液：DMEM+10%FBS+60 mg/L青霉素+100 mg/L鏈霉素，并用0.22 μm微孔濾器過濾。

1.2 材料來源及處理

1.2.1水牛卵巢的收集 從南寧市屠宰場收集中國沼澤型水牛卵巢，收集后放置盛有37℃生理鹽水的保溫瓶，確保2～3 h內送達實驗室。用眼科剪刀將卵巢周圍的脂肪組織去除，用一次性12號10 mL注射器抽取直徑2～6 mm卵泡(大卵泡閉鎖比例較高，小卵泡發(fā)育程度較低)的卵泡液，將卵泡液移至60 mm玻璃皿，體式顯微鏡下觀察卵泡液中GCs狀態(tài)，注意只選取來源于健康卵泡的水牛GCs進行后續(xù)試驗。

1.2.2水牛GCs的分離培養(yǎng) 將抽取卵泡液用孔徑40 μm細胞篩過濾，并收集到離心管，1 200 r/min離心5 min，棄上清后用雙抗鹽酸鹽緩沖液(PBS)重懸清洗細胞，離心再用PBS重懸，如此反復1次，最后將清洗干凈的水牛GCs接種至60 mm細胞培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)。選取第1代生長狀態(tài)良好水牛GCs，傳至12孔板4個孔中，確保每孔細胞貼壁后匯合度至少達到80%，進行后續(xù)睪酮處理相關試驗。

1.3 細胞免疫熒光將水牛原代GCs接種到四孔板培養(yǎng)，待細胞匯合度達到80%左右，棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，再加4%多聚甲醛溶液室溫固定30 min；用阻斷液(含100 mmol/L甘氨酸和0.3%BSA的PBS)清洗3次，然后加入1%Tritonx-100室溫透化15 min；再用5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉2 h；用TBP(Tritonx-BSA-PBS)清洗3次，加入一抗4℃孵育過夜；第2天室溫孵育30 min，用TBP清洗3次，加入二抗室溫孵育1 h；用TBP清洗3次，然后在熒光顯微鏡下觀察染色結果。

1.4 RNA提取、反轉錄和實時定量RT-PCR使用TRIzol試劑裂解已收集的水牛GCs，氯仿和異丙醇抽提，75%酒精清洗，DEPC水溶解即得到細胞總RNA。采用反轉錄試劑盒HiScript Ⅲ RT Super Mix合成cDNA，然后用SYBP Premix Ex TaqTMⅡ試劑進行qRT-PCR。本研究所用引物序列如表1所示，使用GAPDH作為內參基因標準化其他基因表達。

表1 水牛GCs qRT-PCR引物序列及條件反應

1.5 酶聯免疫吸附反應采用酶聯免疫吸附反應(ELISA)檢測水牛GCs培養(yǎng)液中雌激素雌二醇的分泌水平。將水牛GCs培養(yǎng)液收集后，按照ELISA試劑盒說明書(江蘇晶美生物科技有限公司)要求進行樣品的預處理和后續(xù)試驗步驟，用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度值。根據所做標準曲線圖，得出水牛GCs培養(yǎng)液雌二醇的含量。

1.6 試驗設計試驗1：本試驗主要探討細胞培養(yǎng)液中添加不同濃度睪酮對水牛GCs雌激素合成相關基因表達的影響。將處于相同細胞來源和生長狀態(tài)的水牛GCs分別在添加不同濃度睪酮(0，10-9，10-7，10-5mol/L)的培養(yǎng)液中均處理48 h，檢測水牛GCs雌激素合成相關基因(CYP11A1、CYP19-A1、3β-HSD和17β-HSD)的表達情況。

試驗2：本試驗主要探討細胞培養(yǎng)液中添加不同濃度睪酮對水牛GCs雌二醇分泌水平的影響。將處于相同細胞來源和生長狀態(tài)的水牛GCs分別在添加不同濃度睪酮(0，10-9，10-7，10-5mol/L)的培養(yǎng)液中均處理48 h，檢測水牛GCs培養(yǎng)液中雌二醇的分泌水平。

試驗3：本試驗主要探討細胞培養(yǎng)液中不同睪酮處理時間對水牛GCs雌激素合成相關基因表達的影響。將處于相同細胞來源和生長狀態(tài)的水牛GCs分別在添加睪酮濃度10-7mol/L的培養(yǎng)液中處理不同時間(0，24，48，72 h)，檢測水牛GCs雌激素合成相關基因(CYP11A1、CYP19A1、3β-HSD和17β-HSD)的表達情況。

試驗4：本試驗主要探討細胞培養(yǎng)液中不同睪酮處理時間對水牛GCs雌二醇分泌水平的影響。將處于相同細胞來源和生長狀態(tài)的水牛GCs分別在添加睪酮濃度10-7mol/L的培養(yǎng)液中處理不同時間(0，24，48，72 h)，檢測水牛GCs培養(yǎng)液中雌二醇的分泌水平。

1.7 數據分析利用SPSS 22.0軟件對統計數據進行處理并分析差異顯著性，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著，每個試驗至少3次生物學重復(n=3)，即同一試驗處理中用相互獨立的水牛GCs進行至少3次重復。坐標圖中柱狀圖上所標字母不同均表示差異顯著(P<0.05)，所標字母相同均表示差異不顯著(P>0.05)。

2 結果

2.1 水牛卵泡GCs的分離、培養(yǎng)和鑒定選擇直徑為2～6 mm的水牛卵泡用于分離水牛GCs(圖1A)。結果顯示：水牛原代GCs貼壁后呈現成纖維細胞狀，傳代3次后，仍能保持典型GCs形態(tài)(圖1B)；免疫熒光試驗表明水牛GCs表達其特異性蛋白FSHR(圖1C)。 由此說明，本研究所分離獲得細胞為高純度水牛GCs，可作為后續(xù)研究的試驗材料。

A.直徑2～6 mm竇狀健康卵泡用于分離水牛GCs；B.原代水牛GCs以及第1～3代水牛GCs貼壁后細胞生長狀態(tài)；C.細胞免疫熒光試驗顯示水牛GCs表達其特異性蛋白FSHR

2.2 睪酮處理濃度對水牛GCs雌激素合成相關基因表達的影響水牛GCs分別在添加不同濃度睪酮(0，10-9，10-7，10-5mol/L)的培養(yǎng)液中處理48 h后，qRT-PCR檢測水牛GCs雌激素合成相關基因(CYP11A1、CYP19A1、3β-HSD和17β-HSD)表達情況。結果顯示(圖2)：相比對照組(0 mol/L睪酮)，10-7mol/L睪酮處理組水牛GCs顯著上調雌激素合成相關基因CYP11A1、CYP19A1、3β-HSD和17β-HSD表達(P<0.05)，但10-5mol/L睪酮處理組水牛GCs顯著下調雌激素合成相關基因CYP19A1、3β-HSD和17β-HSD表達(P<0.05)。由此初步說明，水牛GCs培養(yǎng)液中睪酮處理濃度以10-7mol/L最佳。

圖2 qRT-PCR檢測睪酮不同處理濃度對水牛GCs雌激素合成相關基因表達的影響

2.3 睪酮處理濃度對水牛GCs雌激素分泌水平的影響水牛GCs分別在添加不同濃度睪酮(0，10-9，10-7，10-5mol/L)的培養(yǎng)液中處理48 h后，ELISA檢測水牛GCs培養(yǎng)液中雌二醇分泌水平情況。結果顯示(圖3)：相比對照組(0 mol/L睪酮)，10-7mol/L睪酮處理組顯著提高水牛GCs培養(yǎng)液中雌二醇的分泌水平(P<0.05)，但10-5mol/L睪酮處理組顯著降低水牛GCs培養(yǎng)液中雌二醇的分泌水平(P<0.05)。由此進一步說明，水牛GCs培養(yǎng)液中睪酮最佳處理濃度為10-7mol/L。

圖3 ELISA檢測睪酮不同處理濃度對水牛GCs培養(yǎng)液中雌二醇分泌水平的影響

2.4 睪酮處理時間對水牛GCs雌激素合成相關基因表達的影響水牛GCs在添加睪酮濃度為10-7mol/L的培養(yǎng)液中處理不同時間(0，24，48，72 h)后，qRT-PCR檢測水牛GCs雌激素合成相關基因(CYP11A1、CYP19A1、3β-HSD和17β-HSD)表達情況。結果顯示(圖4)：相比對照組(睪酮處理時間0 h)，睪酮處理48和72 h組水牛GCs顯著上調雌激素合成相關基因CYP11A1、CYP19A1和3β-HSD表達(P<0.05)。由此初步說明，水牛GCs培養(yǎng)液中睪酮處理時間以48或72 h 最佳。

圖4 qRT-PCR檢測睪酮不同處理時間對水牛GCs雌激素合成相關基因表達的影響

2.5 睪酮處理時間對水牛GCs雌激素分泌水平的影響水牛GCs在添加睪酮濃度為10-7mol/L 的培養(yǎng)液中處理不同時間(0，24，48，72 h)后，ELISA檢測水牛GCs培養(yǎng)液中雌二醇分泌水平情況。結果顯示(圖5)：相比對照組(睪酮處理時間0 h)，睪酮處理48或72 h組顯著提高水牛GCs培養(yǎng)液中雌二醇的分泌水平(P<0.05)。由此進一步說明，水牛GCs培養(yǎng)液中睪酮最佳處理時間是48 或72 h。

圖5 ELISA檢測睪酮不同處理時間對水牛GCs培養(yǎng)液中雌二醇分泌水平的影響

綜合上述：10-7mol/L睪酮處理水牛GCs 48或72 h有利于提高水牛GCs雌激素的合成能力。

3 討論

水牛是我國南方主要大家畜之一，因其具有適應性強、耐高溫耐高濕、抗病力強、耐粗飼易飼養(yǎng)、乳品價值高和使用年限長等生物學特性，而具有巨大經濟效益和社會效益[18-23]。然而目前水牛存在繁殖率低、種群生產性能低下等問題，因此，開展水牛卵泡發(fā)育激素分泌機制相關研究可為提高水牛繁殖力以及加快水牛遺傳改良步伐等提供基礎理論依據。根據雙細胞-雙促性腺激素理論，卵巢內雌激素主要由GCs分泌，卵泡在促黃體素的作用下，卵泡內膜細胞產生睪酮進入GCs，促卵泡素刺激GCs芳香化酶活性，在該酶催化下睪酮轉化為雌二醇。GCs合成雌激素是在促卵泡素調控下，細胞表達雌激素合成相關基因CYP11A1、CYP19-A1、3β-HSD和17β-HSD，其中CYP19A1編碼雌激素合成關鍵限速酶[13,24-28]。本研究結果表明，10-7mol/L睪酮處理水牛GCs 48或72 h，不但提高水牛GCs雌激素合成相關基因CYP11A1、CYP19A1和3β-HSD表達，而且促進水牛GCs培養(yǎng)液中雌二醇分泌水平。該結果說明睪酮能提高水牛GCs雌激素的合成能力，這與內膜細胞條件液影響水牛GCs雌激素合成能力的結果類似[29]。

水牛GCs和內膜細胞互作的最新研究表明，水牛內膜細胞條件液能促進水牛GCs雌激素的合成能力，且水牛內膜細胞主要分泌雄激素睪酮到內膜細胞條件液中[30]。而本研究結果也顯示，睪酮能提高水牛GCs雌激素的合成能力，這更進一步證實了水牛GCs和內膜細胞互作的研究結果。但睪酮促進水牛GCs雌激素合成的調控機理仍有待進一步探討，特別是睪酮添加到水牛GCs培養(yǎng)液中，究竟是通過直接作用即增加了GCs雌激素合成芳香化酶作用的底物進而促進雌激素合成，還是通過間接作用即激活了GCs雌激素合成調控的相關信號通路進而促進雌激素合成，這將是我們下一步重點研究的內容。

同時，本研究指出睪酮能提高水牛GCs雌激素的合成，那么睪酮在水牛卵泡發(fā)育過程中，對水牛原始卵泡的體外激活、腔前卵泡的體外培養(yǎng)、卵母細胞的體外成熟甚至早期胚胎的體外發(fā)育是否會有影響，以及產生這些影響的調控機制，這些課題是我們更希望探究的。相信隨著研究的逐漸深入和系統，雄激素調控卵泡發(fā)育的相關研究結果，將為更進一步研究水牛卵泡發(fā)育的激素調控規(guī)律奠定堅實基礎。