李富祥，王慧輝，趙文華，高華峰，宋建領(lǐng)，王生奎，楊仕標(biāo)*

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650201)

抗生素作為疾病預(yù)防和治療藥物以及生長(zhǎng)促進(jìn)劑被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖行業(yè)，抗生素的長(zhǎng)期超范圍、超劑量應(yīng)用導(dǎo)致畜禽耐藥細(xì)菌和耐藥基因產(chǎn)生和擴(kuò)散，不僅大大增加了畜禽細(xì)菌病治療的難度，而且畜禽耐藥細(xì)菌可通過(guò)畜產(chǎn)品直接傳播給人，畜禽細(xì)菌耐藥基因也可通過(guò)細(xì)菌間的水平傳播給人的致病菌[1]，給人類(lèi)細(xì)菌病的防控也造成威脅，引發(fā)公共衛(wèi)生問(wèn)題。因此，開(kāi)展畜禽細(xì)菌耐藥基因分布特征研究對(duì)畜禽細(xì)菌病的防控和人類(lèi)公共衛(wèi)生具有重要意義。

目前，畜禽細(xì)菌耐藥基因研究已受到國(guó)內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注，已有大量關(guān)于畜群細(xì)菌耐藥基因的研究報(bào)道，但絕大部分都是關(guān)于某一特定種類(lèi)細(xì)菌的耐藥基因研究報(bào)道[2-3]。也有少量關(guān)于腸道[4]、糞便[5]、污水[6]、土壤[7]等畜群養(yǎng)殖環(huán)境中菌群耐藥基因的研究報(bào)道。未見(jiàn)我國(guó)從致病菌的角度，對(duì)來(lái)源于病死畜禽的多種潛在致病菌耐藥基因的研究報(bào)道。本研究對(duì)來(lái)源于云南省昆明市、保山市、普洱市、紅河州和楚雄州的病死畜禽中的大腸桿菌、腸炎沙門(mén)菌、多殺性巴氏桿菌、豬鏈球菌和鴨源雞桿菌等多種潛在致病菌94株，進(jìn)行β-內(nèi)酰胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)和氯霉素類(lèi)共23種耐藥基因檢測(cè)，分析耐藥基因分布特征，以期為了解云南畜禽潛在致病菌耐藥基因分布規(guī)律，為云南省畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)獸醫(yī)臨床抗生素的科學(xué)應(yīng)用和細(xì)菌耐藥機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株94株細(xì)菌為云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2020年分離自云南省昆明市、保山市、普洱市、紅河州和楚雄州的病死豬、牛、羊和雞。包括大腸桿菌(Escherichiacoli) 19株、腸炎沙門(mén)菌(Salmonellaenterica)6株、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)6株、痢疾志賀菌(Shigelladysenteriae)15株、鴨源雞桿菌(Gallibacteriumanatis) 4株、奇異變形桿菌(Proteusmirabilis) 9株、偽結(jié)核棒狀桿菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis)9株、綿羊莫拉桿菌(Moraxellaovis) 3株、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) 4株、豬鏈球菌(Streptococcussuis) 4株、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)6株、多動(dòng)物鏈球菌(Streptococcuspluranimalium)5株和鼠口腔鏈球菌(Streptococcusorisratti)4株。全部菌株保存于云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；蛋白酶K和DL2000 DNA Marker購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；2×EasyTaq PCR SuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)細(xì)菌耐藥基因引物按參考文獻(xiàn)[8-21]報(bào)道的引物序列設(shè)計(jì)，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，引物序列、退火溫度及PCR產(chǎn)物片段大小見(jiàn)表1。

表1 耐藥基因引物序列

1.4 耐藥基因PCR檢測(cè)

1.4.1DNA的提取 分別將94株細(xì)菌接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，用滅菌超純水將菌落洗脫下來(lái)制成菌懸液，用滅菌超純水將菌懸液濃度調(diào)至約2.0×108CFU/mL，按照參考文獻(xiàn)[22]介紹的煮沸法分別提取94株細(xì)菌的DNA作為PCR反應(yīng)的模板。

1.4.2耐藥基因的PCR檢測(cè) 25.0 μL PCR反應(yīng)體系：ddH2O 10.1 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，上、下游引物(25 μmol/L)各0.2 μL，DNA模板2.0 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min；94℃30 s、各引物退火溫度退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察檢測(cè)結(jié)果。

1.5 畜禽耐藥基因分布特征根據(jù)耐藥基因檢測(cè)結(jié)果，分析94株畜禽細(xì)菌中23種耐藥基因的檢出率以及各種多重耐藥基因菌株的檢出比例。

1.6 不同地區(qū)畜禽細(xì)菌耐藥基因分布特征根據(jù)耐藥基因檢出結(jié)果，分析紅河州(19株)、昆明市(22株)、保山市(21株)、普洱市(17株)和楚雄州(15株)5個(gè)不同地區(qū)畜禽細(xì)菌攜帶耐藥基因種類(lèi)和每株細(xì)菌平均攜帶耐藥基因數(shù)量的差異。

1.7 不同畜禽種類(lèi)細(xì)菌耐藥基因分布特征根據(jù)耐藥基因檢出結(jié)果，分析豬(29株)、牛(9株)、羊(20株)和雞(36株)4種不同動(dòng)物細(xì)菌攜帶耐藥基因的種類(lèi)和每株細(xì)菌平均攜帶耐藥基因數(shù)量的差異。

1.8 不同種類(lèi)細(xì)菌耐藥基因分布特征根據(jù)耐藥基因檢出結(jié)果，分析M.ovis(3株)、E.faecalis(6株)、E.coli(19株)、G.anatis(4株)、C.pseudotuberculosis(9株)、P.mirabilis(9株)、P.multocida(6株)、S.enterica(6株)、S.dysenteriae(15株)、S.aureus(4株)、S.suis(4株)、S.pluranimalium(5株)和S.orisratti(4株)耐藥基因分布特征。

2 結(jié)果

2.1 畜禽細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)及分布特征用23種耐藥基因引物對(duì)94株畜禽細(xì)菌DNA樣品進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，23種耐藥基因均有檢出，其中aacA4(90.43%)檢出率最高、其次是floR(87.23%)、tetA(80.85%)、qnrS(77.66%)、qnrD(74.47%)、tetM(71.28%)、sul2(69.15%)、aadA1(53.19%)、blaTEM(45.74%)、sul1(40.43%)、sul3(38.30%)、tetL(21.28%)、ermB(17.02%)、aadA2(14.89%)、tetB(13.83%)、ermA(10.64%)、qnrC(9.57%)、blaEBC(7.45%)、tetG(5.32%)、qnrB(4.26%)、blaCIT(3.19%)、ermC(3.19%)和blaCTXM(2.13%)。94株細(xì)菌均攜帶3種及以上耐藥基因，其中攜帶8種及以上耐藥基因數(shù)的菌株比例為73.40%(表2)，表明云南畜禽細(xì)菌攜帶耐藥基因的種類(lèi)和每株細(xì)菌平均攜帶耐藥基因的數(shù)量均較多。

表2 云南省畜禽細(xì)菌攜帶耐藥基因情況

2.2 不同地區(qū)畜禽細(xì)菌耐藥基因分布特征統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，不同地區(qū)畜禽細(xì)菌耐藥基因的種類(lèi)存在差異：紅河州畜禽細(xì)菌未檢出blaCTXM、blaCIT、blaEBC、ermC和qnrB；昆明市畜禽細(xì)菌未檢出ermA、ermB、ermC、tetB、tetG和qnrC；保山市畜禽細(xì)菌未檢出blaCTXM、blaCIT和ermC。普洱市畜禽細(xì)菌未檢出blaCTXM、blaCIT、ermB和qnrB；楚雄州畜禽細(xì)菌未檢出blaCTXM、blaEBC、emrC、tetG、tetL、qnrB和qnrC；其他耐藥基因在不同地區(qū)畜禽細(xì)菌中均有檢出。不同地區(qū)畜禽細(xì)菌各菌株平均攜帶耐藥基因數(shù)量存在差異，保山市畜禽細(xì)菌各菌株平均攜帶耐藥基因數(shù)量(11.24種)最高，與其他地州畜禽細(xì)菌各菌株平均攜帶耐藥基因數(shù)量之間差異較大；其他地州畜禽細(xì)菌各菌株平均攜帶耐藥基因數(shù)量依次為：紅河州>昆明市>普洱市>楚雄州，其間差異較小(7.53～9.11株)(圖1)。

圖1 不同地區(qū)畜禽細(xì)菌耐藥基因分布

2.3 不同種類(lèi)畜禽細(xì)菌種類(lèi)耐藥基因分布特征統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，豬、牛、羊和雞細(xì)菌耐藥基因檢出種數(shù)分別為21種(僅blaCIT、blaEBC未檢出)、15種(僅blaCTXM、aadA2、ermA、ermB、ermC、TetB、tetG和qnrC未檢出)、18種(僅blaCTXM、blaCIT、blaEBC、ermC和qnrB未檢出)和22種(僅ermC未檢出)。不同畜禽種類(lèi)細(xì)菌各菌株平均攜帶耐藥基因數(shù)量存在差異，雞細(xì)菌各菌株平均攜帶耐藥基因數(shù)量(9.11種)最高，與牛、羊、豬細(xì)菌各菌株平均攜帶耐藥基因數(shù)量之間差異較大(圖2)；其他畜禽種類(lèi)細(xì)菌各菌株平均攜帶耐藥基因數(shù)量依次為：豬>牛>羊，其間差異較小(圖2)。

圖2 不同種類(lèi)畜禽細(xì)菌耐藥基因分布

2.4 不同種類(lèi)細(xì)菌耐藥基因分布特征統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，不同種類(lèi)細(xì)菌攜帶耐藥基因的種類(lèi)存在差異，S.dysenteriae攜帶耐藥基因種類(lèi)(20.0種)最多，其次是S.suis(5.0種)、M.ovis(8.0種)和P.multocida(9.0種)，其他種類(lèi)細(xì)菌攜帶耐藥基因種類(lèi)為11.0～17.0種。不同種類(lèi)細(xì)菌各菌株平均攜帶耐藥基因數(shù)量為3.5～11.0種(圖3)，其中E.faecalis各菌株平均攜帶耐藥基因數(shù)量(11.0種)最大(圖3)，S.suis各菌株平均攜帶耐藥基因數(shù)量(3.5種)最小(圖3)。

圖3 不同種類(lèi)細(xì)菌耐藥基因分布

3 討論

耐藥基因是細(xì)菌耐藥性形成的重要因素，為了解云南畜禽潛在致病菌耐藥基因分布狀況，本研究首次從致病菌的角度，對(duì)來(lái)源于云南省5個(gè)不同地州、4種不同種類(lèi)畜禽的13種潛在致病菌94株，進(jìn)行β-內(nèi)酰胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)和氯霉素類(lèi)共23種耐藥基因檢測(cè)。結(jié)果顯示，23種耐藥基因均有檢出，其中aacA4、floR、tetA、qnrS、qnrD、tetM、sul2、aadA1、blaTEM、sul1、sul3、tetL共13種耐藥基因的檢出率均高于20.00%，是云南省畜禽細(xì)菌攜帶的主要耐藥基因；94株細(xì)菌均攜帶3種及以上耐藥基因，其中攜帶8種及以上耐藥基因數(shù)的菌株比例為73.40%(表2)；表明云南畜禽細(xì)菌耐藥基因的種類(lèi)和每株細(xì)菌平均攜帶耐藥基因的數(shù)量都較大，應(yīng)引起足夠的重視

耐藥基因統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，云南不同種類(lèi)畜禽細(xì)菌耐藥基因的種類(lèi)和數(shù)量存在差異，雞細(xì)菌耐藥基因的種類(lèi)(22.00種)和每株細(xì)菌平均攜帶耐藥基因數(shù)量(9.11種)均高于豬、牛和羊細(xì)菌耐藥基因的種類(lèi)(分別為21.00，15.00和18.00種)和每株細(xì)菌平均攜帶耐藥基因數(shù)量(分別為8.17，7.89和7.75種)，可能是由于養(yǎng)雞業(yè)頻繁、大量使用β-內(nèi)酰胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)和氯霉素類(lèi)抗生素有關(guān)。耐藥基因統(tǒng)計(jì)結(jié)果還顯示，不同地區(qū)畜禽細(xì)菌耐藥基因的分布也存在差異，保山市畜禽細(xì)菌耐藥基因的種類(lèi)(20.00種)和每株細(xì)菌平均攜帶耐藥基因數(shù)量(11.24種)均高于紅河州、昆明市、普洱市和楚雄州畜禽細(xì)菌耐藥基因的種類(lèi)(分別為18.00，17.00，19.00和16.00種)和每株細(xì)菌平均攜帶耐藥基因數(shù)量(分別為9.11，9.09，8.82和7.53種)，可能是由于該地區(qū)頻繁、大量使用多種抗生素有關(guān)。

不同種類(lèi)細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果表明，E.faecalis檢出blaTEM、aadA1、aacA4、sul1、sul2、sul3、ermA、ermB、tetA、tetL、tetM、floR、qnrC、qnrD和qnrS共15種耐藥基因，其中ermA(66.67%)的檢出率明顯高于深圳(3.10%)[23]；ermB(83.33%)的檢出率與深圳(64.70%)[23]和上海(95.50%)[24]一致；tetM(100.00%)檢出率與顧欣等[24]報(bào)道的上海(91.00%)檢出率一致。G.anatis檢出blaTEM、aadA1、aacA4、sul1、sul2、sul3、ermA、ermB、tetA、tetB、tetM、floR、qnrC和qnrD，其中tetB(50.00%)檢出率與BOJESEN等[25]報(bào)道的丹麥和墨西哥(55.10%)檢出率高度一致；tetA(100.00%)、tetM(75.00%)的檢出率與丹麥和墨西哥(均為0)[25]檢出率差異很大；tetL(0)與丹麥和墨西哥(2.04%)[25]檢出率不一致；其他耐藥基因的檢出均為國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道。P.multocida檢出aadA1、aacA4、sul1、sul2、tetA、tetB、floR、qnrD和qnrS，其中sul1(100.00%)和sul2(100.00%)檢出率與陳紅梅等[26]報(bào)道的福建省、廣東省和江西省鴨源P.multocidasul1(100.00%)和sul2(97.00%)檢出率高度一致；floR(100.00%)檢出率明顯高于陳紅梅等[27]報(bào)道的福建省、廣東省和江西省禽源P.multocida(64.04%)檢出率；floR、blaTEM(0)、aacA4(100.00%)和tetB(100.00%)陽(yáng)性率與KHAC等[28]報(bào)道的越南豬源P.multocidafloR(6.00%)、blaTEM(7.20%)、aacA4(8.40%)和tetB(45.80%)的檢出率差異都很大。C.pseudotuberculosis首次檢出blaEBC、aadA1、aacA4、sul1、sul2、sul3、tetA、tetM、floR、qnrD和qnrS；C.pseudotuberculosis未檢出blaTEM和blaCTXM，與王峰[29]報(bào)道的山西省blaTEM(92.86%)和blaCTXM(100.00%)檢出率存在很大差異，表明我國(guó)不同地區(qū)blaTEM檢出率差異很大。S.enterica檢出blaTEM、blaEBC、aadA1、aacA4、sul1、sul2、tetA、tetG、tetL、tetM、floR、qnrB、qnrD和qnrS，其中blaTEM(100.00%)、tetA(83.33%)和sul1(33.33%)的檢出率較高與陸彥等[30]報(bào)道的山東雞S.entericablaTEM(88.00%)、tetA(82.80%)和sul1(33.33%)高度一致。S.suis檢出aacA4、ermB、tetA、tetM和qnrD，其中ermB(100.00%)檢出率與關(guān)琳等[31]報(bào)道的江蘇省、廣東省、山東省和上海市的檢出率相同；tetM(100%)的檢出率明顯高于江蘇省、廣東省、山東省和上海市(6.67%)檢出率；tetB未檢出，而王治方等[32]報(bào)道的河南省檢出率高達(dá)89.00%，兩者差異很大。S.pluranimalium檢出aadA1(20.00%)、aacA4(100.00%)、sul1(60.00%)、sul2(40.00%)、sul3(80.00%)、tetA(40.00%)、tetL(60.00%)、tetM(80.00%)、floR(100.00%)、qnrD(100.00%)和qnrS(100.00%)。S.orisratti檢出blaTEM(25.00%)、aadA1(25.00%)、aacA4(100.00%)、sul2(50.00%)、sul3(50.00%)、ermB(75.00%)、tetA(75.00%)、tetL(100.00%)、tetM(75.00%)、floR(100.00%)、qnrD(100.00%)和qnrS(50.00%)。M.ovis檢出aacA4(100%)、sul2(50.00%)、tetA(50.00%)、tetM(75.00%)、floR(50.00%)、qnrC(25.00%)、qnrD(75.00%)和qnrS(100.00%)。本研究首次報(bào)道S.pluranimalium、S.orisratti和M.ovis的耐藥基因，對(duì)進(jìn)一步研究其耐藥基因分布特征和耐藥機(jī)制具有重要意義。