易江南，陳漢明，劉冰賢，黎遠(yuǎn)亮，劉瑩煒，楊必婧，黎揚(yáng)威，張 輝，唐兆新，李 英

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

玉米赤霉烯酮(ZEA)常存于霉變谷物，且不易在加工中降解，易導(dǎo)致動(dòng)物食物源性慢性中毒。ZEA對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、腎臟和肝臟具有毒性作用[1-2]，并且能引起動(dòng)物體內(nèi)生殖內(nèi)分泌紊亂，影響睪丸激素的合成和分泌，擾亂精子的發(fā)生過程，破壞生殖能力[3]。

近年來，不少學(xué)者關(guān)注于ZEA對(duì)雄性動(dòng)物生殖毒性的作用機(jī)制。有研究表明，單次腹腔注射ZEA通過擾亂內(nèi)分泌系統(tǒng)，抑制睪酮生成，最終導(dǎo)致生殖系統(tǒng)短暫性的損傷[3]。

ZEA能誘導(dǎo)小鼠的睪丸發(fā)生氧化應(yīng)激(ROS)，ROS導(dǎo)致電子傳輸鏈的損傷，最終導(dǎo)致線粒體功能障礙并誘導(dǎo)促凋亡介質(zhì)的釋放，引起細(xì)胞凋亡[4]。自噬是真核生物高度保守的細(xì)胞過程，可降解受損的細(xì)胞器[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，ROS可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或自噬，或兩者兼而有之[6-7]。

本試驗(yàn)通過灌胃方式建立小鼠ZEA長期染毒模型，分析ZEA對(duì)小鼠睪丸和精子損傷，以及凋亡自噬相關(guān)蛋白及mRNA表達(dá)的影響，以探討ZEA對(duì)雄性小鼠生殖能力影響的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用雄性昆明小鼠(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，所有小鼠在試驗(yàn)開始前適應(yīng)環(huán)境1周并保持在相對(duì)環(huán)境中。將20只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(CON組)和玉米赤霉烯酮處理組(ZEA組)，ZEA組小鼠根據(jù)20 mg/kg的劑量經(jīng)口灌服ZEA，CON組小鼠口服相同體積的生理鹽水。飼養(yǎng)28 d后，頸椎脫臼處死小鼠后迅速取出睪丸，并迅速取出附睪尾，在緩沖液中制備成精子懸液。

1.2 精子濃度和能動(dòng)精子百分比將精子懸液置于流式細(xì)胞儀上，計(jì)算精子濃度。在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上滴1滴精子懸液，在顯微鏡下對(duì)能動(dòng)精子進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算能動(dòng)精子百分比。

1.3 染色質(zhì)狀態(tài)評(píng)估(SCSA)將精液樣品在EK稀釋液中稀釋至終濃度為1×106個(gè)/mL的混懸液，將精液懸浮液200 μL與400 μL Lysis Solution裂解液，混合30 s進(jìn)行短暫的酸變性并混合含1.2 mL AO溶液，3 min后，將樣品吸到流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 線粒體功能的評(píng)估將精液樣品在EK稀釋液中稀釋至終濃度為1×106個(gè)/mL的混懸液，將10 μL R123溶液加入500 μL稀釋精液中，室溫黑暗中孵育20 min。500×g離心3 min后，移去上清，再將精子顆粒用500 μL EK溶液重懸，最后加入5 μL的PI上機(jī)檢測(cè)。

1.5 睪丸指數(shù)快速采集睪丸并稱重，并計(jì)算睪丸指數(shù)：睪丸指數(shù)=睪丸質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.6 睪丸組織形態(tài)染色及觀察用4%多聚甲醛固定睪丸組織，經(jīng)流水過夜，脫水、透明、浸蠟、包埋處理。組織切片(5 μm)后放入展片臺(tái)上，55℃烤1 h，再進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察。

1.7 睪丸組織免疫化學(xué)染色及觀察石蠟切片(5 μm)經(jīng)脫蠟、復(fù)水、抗原修復(fù)、H2O2處理、封閉后滴加一抗孵育過夜，隨后二抗孵育，滴加DAB顯色液。最后用蘇木精染核、鹽酸酒精分化、脫水、透明、封片。

1.8 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)用RIPA裂解液從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)。將提取的蛋白樣在垂直電泳儀上經(jīng)SDS-PAGE分離后，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗在4℃下孵育16 h，然后與二抗反應(yīng)，用ECL試劑盒發(fā)光，使用成像相機(jī)捕獲凝膠圖像，并使用Image J分析條帶密度。

1.9 RT-qPCR檢測(cè)基因表達(dá)提取組織總RNA，測(cè)定濃度后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA采用染料法進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參照基因。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 小鼠生殖能力評(píng)價(jià)ZEA組小鼠附睪中精子數(shù)量下降(圖1A)、能動(dòng)精子百分率顯著降低(P<0.01)(圖1B)；未成熟精子比例增高(圖1C)、活躍線粒體的活精子比例下降趨勢(shì)(圖1D)，但均不顯著(P>0.05)。結(jié)果提示，連續(xù)28 d以20 mg/kg劑量飼喂ZEA的小鼠生殖能力受損。

A.精子濃度；B.能動(dòng)精子百分?jǐn)?shù)；C.染色質(zhì)狀態(tài)評(píng)估(SCSA);D.線粒體功能評(píng)估。**P<0.01

2.2 ZEA對(duì)小鼠睪丸細(xì)胞損傷的影響小鼠經(jīng)20 mg/kg 劑量的ZEA連續(xù)28 d染毒后其睪丸指數(shù)升高，但差異不顯著(P>0.05)(圖2A)。睪丸石蠟切片和HE染色后觀察發(fā)現(xiàn)，ZEA組小鼠睪丸曲精小管中的生精細(xì)胞分散、排列紊亂，生精細(xì)胞層數(shù)減少，并出現(xiàn)空泡變化(圖2B)。結(jié)果提示本染毒劑量的ZEA處理可導(dǎo)致小鼠睪丸組織損傷。

A.睪丸指數(shù)；B.小鼠睪丸組織的HE染色(×400)(箭頭1所指示為正常排列的生精細(xì)胞；箭頭2所指示為排列分散的生精細(xì)胞；箭頭3指示為空泡變化)

2.3 線粒體路徑凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，Bax、Cytc陽性表達(dá)主要在各級(jí)精細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，Bcl-2陽性表達(dá)主要在精母細(xì)胞的細(xì)胞核周圍，并且陽性細(xì)胞被染成棕色(圖3)。從表觀上可以發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，ZEA組睪丸中的Cytc蛋白陽性數(shù)量明顯提升。

圖3 凋亡相關(guān)蛋白免疫組化觀察 (×400)

凋亡相關(guān)mRNA的表達(dá)水平如圖4A所示，與對(duì)照組相比，ZEA組睪丸組織Bax、Cytc和P53的mRNA水平呈上升的趨勢(shì)，其中Bax的上升趨勢(shì)極顯著(P<0.01)，而Bcl-2的mRNA水平下降。凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(圖4B)，與對(duì)照組相比，暴露于ZEA后，Bcl-2、Bax、P53的蛋白表達(dá)下降，Caspase-3、Cytc蛋白表達(dá)上升，其中Cytc的表達(dá)上升極顯著(P<0.01)。

A.凋亡相關(guān)基因表達(dá)；B.凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。**P <0.01

2.4 自噬相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)如圖5所示，與對(duì)照組相比，ZEA能上調(diào)小鼠睪丸組織中ATG5、Beclin1、LC3-Ⅱ和P62的mRNA水平，但并沒有顯著性的差異(P>0.05)；Western blot分析結(jié)果顯示，ATG5、Beclin1、LC3-Ⅱ和P62的蛋白水平上升，但并沒有顯著性的差異(P>0.05)。

A.自噬相關(guān)基因表達(dá)；B.自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)20 mg/kg的飼喂劑量下，ZEA能使附睪中未成熟精子的比例升高，并降低能動(dòng)精子的比例和活躍線粒體的活精子數(shù)。通過病理學(xué)切片，可以發(fā)現(xiàn)小鼠睪丸生精小管中的細(xì)胞排列雜亂、生精細(xì)胞層數(shù)減少、生精細(xì)胞分離、并出現(xiàn)空泡變化。結(jié)果提示ZEA能造成小鼠睪丸損傷并降低生殖能力。

目前，一些在體內(nèi)和體外的試驗(yàn)證明，ROS是ZEA誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的決定性因素[8-9]，線粒體是細(xì)胞產(chǎn)生ROS的主要部位，ROS介導(dǎo)的線粒體功能障礙是許多疾病的潛在致病要素[10]，而在細(xì)胞凋亡調(diào)控中線粒體發(fā)揮重要作用[11]。細(xì)胞凋亡受多種蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)，Bcl-2相關(guān)蛋白是凋亡信號(hào)進(jìn)入線粒體并引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵，它與其對(duì)立的系列蛋白共同決定細(xì)胞的凋亡程序[12]。在受到凋亡刺激因素時(shí)，促凋亡蛋白Bax堆積在線粒體，使線粒體膜的通透性發(fā)生變化，CytC從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，然后激活Caspases途徑來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。因此，Bax/Bcl-2的比重是決定細(xì)胞存活和死亡的關(guān)鍵因素之一[14]。P53被認(rèn)為有雙重作用：一個(gè)是保護(hù)細(xì)胞，另一個(gè)是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。在本次試驗(yàn)中，暴露于ZEA后，小鼠睪丸中Bcl-2的蛋白表達(dá)量有一定程度的下降，CytC和Caspase-3的蛋白表達(dá)上升，其中Cytc上升的趨勢(shì)極顯著(P<0.01)。這提示ZEA暴露能增強(qiáng)睪丸的凋亡水平。有研究表明，在40 mg/kg的劑量下，ZEA能顯著提升Bax的蛋白水平[16]，而在我們的試驗(yàn)中Bax、P53的蛋白水平呈下降的趨勢(shì)，Bax/Bcl-2的比例沒有明顯的變化，可能與ZEA的劑量和暴露時(shí)間有關(guān)。先前報(bào)道顯示：在ZEA給藥10 d內(nèi)，大鼠肝臟中的SOD活性增加，而在給藥10 d后，大鼠肝臟中的SOD含量沒有明顯變化[17]，提示ZEA的毒性作用與劑量和暴露時(shí)間有關(guān)。因此，還需要更多的試驗(yàn)來驗(yàn)證不同劑量和時(shí)間的ZEA暴露對(duì)小鼠睪丸的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，Bax、Cytc和P53的mRNA水平上升，Bcl-2的mRNA水平下降。這說明在基因水平上，ZEA誘導(dǎo)小鼠睪丸細(xì)胞啟動(dòng)內(nèi)源性線粒體通路介導(dǎo)的凋亡。

自噬與線粒體受損有關(guān)，線粒體作為興奮等信號(hào)通路的調(diào)節(jié)器，對(duì)導(dǎo)致自噬的毒素做出適應(yīng)性反應(yīng)[18-19]。有研究表明，用0(對(duì)照組)，0.1，1.0，10.0，20.0，30.0 μmol/L等不同濃度的ZEA處理睪丸支持細(xì)胞，細(xì)胞自噬增強(qiáng)，且濃度越高差異越顯著[20]。而在本試驗(yàn)中，暴露于ZEA會(huì)增加小鼠睪丸LC3-Ⅱ、Beclin1、P62和Atg5的蛋白和mRNA表達(dá)，但這些結(jié)果沒有明顯的差異，表明自噬途徑不參與20 mg/kg的ZEA持續(xù)灌胃小鼠誘導(dǎo)的睪丸細(xì)胞損傷。

綜上所述，ZEA通過誘導(dǎo)睪丸細(xì)胞線粒體路徑的凋亡，引起睪丸的損傷和生殖能力的下降。