簡小蘭 李克雄 何鳳姣 蔣益蘭

（1.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院腫瘤科，湖南 長沙 410006；2.湖南中醫(yī)藥大學研究生院,湖南 長沙 410006）

結(jié)直腸癌是世界上最致命的和常見的惡性腫瘤之一[1]，發(fā)病率及病死率在全球均居于第3 位，在我國的發(fā)病率和病死率分別為第4 和5 位[2]，約1/3 的患者在確診時已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移[3]。結(jié)直腸癌患者的5 年生存率約為64%，轉(zhuǎn)移性患者5 年生存率僅約12%[1]，結(jié)直腸癌的治療仍然需要進一步研究開發(fā)有效藥物，抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌臨床治療的關(guān)鍵。中醫(yī)藥干預(yù)是改善轉(zhuǎn)移性腸癌患者預(yù)后的保護因子[4]。本課題組采用中藥健脾消癌方治療結(jié)直腸癌在臨床上已獲得較好療效[5，6]。前期本課題組進行細胞實驗發(fā)現(xiàn)健脾消癌方具有抑制腸癌細胞生長，促進細胞凋亡，阻滯細胞周期的作用，可以抑制細胞遷移及侵襲[7]，但其抗轉(zhuǎn)移機制研究仍有待進一步深入探索，且需進一步研究抗結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移不同治法中藥發(fā)揮作用。本實驗建立腸癌裸鼠模型，觀察不同治法中藥組轉(zhuǎn)移率，檢測mTOR 信號通路相關(guān)蛋白的表達情況，進一步探索健脾消癌方及拆方對結(jié)直腸癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物和細胞株 BALB/C-nu/nu 裸鼠，SPF 級，（20±2）g，雌雄各半，64 只，購自湖南長沙斯萊克實驗動物中心，許可證號：SCXK（湘）2013-0004。細胞株人結(jié)腸癌細胞株HCT116 購買于中國科學院細胞庫，編號TCHu 99。

1.2 主要試劑及儀器 BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天，P0012）；mTOR（Y391）、p-mTOR（phospho S2448）、S6K1（E343）、p-S6K1（phospho T389）、4EBP1（Y329）、p-4EBP1（phospho T37）及β-actin（AC-15）、Tubulin（DM1A）一抗購均自abcam 公司；山羊抗小鼠IgG（康為世紀，01325/50237）；山羊抗兔IgG（中杉金橋，119986）。全自動酶標儀（BioTek 公司，型號：EIX808U），Hoefer電泳（Hoefer 公司，型號：SE300），Hoefer 轉(zhuǎn)膜儀（Hoefer 公司，型號：SE300），凝膠成像系統(tǒng)（Syngene公司，型號：G：B0X）。

1.3 健脾消癌方及其拆方制備 全方與拆方的中藥煎劑：人參10 g，薏苡仁30 g（健脾益氣組），半枝蓮30 g，重樓10 g，莪術(shù)10 g，郁金15 g（化瘀解毒組），健脾消癌方（全方）組。方法：藥物購自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房，按所需藥量2 倍量處方，溫水中浸泡1 h，水量超出藥物3～5 cm，大火煮沸，小火繼續(xù)煎煮30 min，藥渣按前法再煎煮1 次，將2 次藥液混勻，用離心沉淀器除去藥物殘渣，恒溫水浴箱上濃縮為相當于生藥1.5 g/mL，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 瘤源制備與動物造模

1.4.1 瘤源制備 培養(yǎng)HCT116 細胞，收集細胞懸液調(diào)整濃度為2×107/mL，取細胞懸液0.1 mL，即接種細胞數(shù)為2×106個，注射到10 只BALB/C-nu/nu 裸鼠右腋下，觀察裸鼠腋下種植瘤生長，將長出直徑1 cm 左右的實體瘤，作為原位移植瘤的瘤源，大約2 周。

1.4.2 結(jié)直腸癌動物模型造模 脫頸處死瘤源裸鼠，剝離腋下腫瘤，浸入生理鹽水中，取腫瘤中心靠近邊緣處的組織，剪成1 mm3組織塊備用。10%的水合氯醛（40 mg/kg）腹腔注射麻醉裸鼠，消毒后左下腹部切口進入腹腔，尋找盲結(jié)腸并暴露，用1 mL 小針頭輕輕將盲結(jié)腸交界處漿膜刮破，稍有滲出血液，將瘤塊1 粒貼于漿膜劃破處，10 μ L OB 膠黏貼瘤塊，盲結(jié)腸回納入腹腔，縫合腹壁。裸鼠麻醉清醒后，常規(guī)飼養(yǎng)在SPF 級動物房中。造模約15 d 后，腹部可捫及小腫塊，并處死2 只裸鼠觀察到有瘤體種植生長可評定造模成功。

1.5 分組與給藥 50 只造模成功的裸鼠隨機分為模型組、健脾益氣組、化瘀解毒組、全方組、雷帕霉素組，每組10 只。造模后第15 天給藥干預(yù)：模型組以0.2 mL生理鹽水灌胃，1 次/d，每周灌藥5 d；中藥各組，裸鼠每日給15 g/kg（約0.2 mL）灌胃給藥，1 次/d，每周灌藥5 d；雷帕霉素組按1 mg/kg（約0.02 mg）腹腔注射給藥，每周2 次，并給予生理鹽水灌胃，每周5 d；干預(yù)4 周。

1.6 常規(guī)觀察 每天記錄動物精神、飲食、活動、二便，每周測定體質(zhì)量。死亡動物，進行瘤體剝離及稱重。

1.7 腫瘤組織取材 4 周后處死裸鼠，取盲腸、腹腔淋巴結(jié)、肝組織、肺組織，剝離腫瘤，稱重，按轉(zhuǎn)移部位記錄各組腫瘤轉(zhuǎn)移情況，病理切片陽性定為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，血性腹水者定為腹膜轉(zhuǎn)移。

1.8 Western blot 檢測mTOR 信號通路蛋白的表達 各組取腫瘤0.2 g，剪碎放入裂解液中進一步勻漿，離心取上清液即為總蛋白，BCA 試劑盒進行蛋白濃度測定。取50 μ g 蛋白上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，封閉，一抗室溫孵育4 h、二抗室溫孵育2 h，ECL 發(fā)光，β-actin、tubulin 為內(nèi)參。使用Image J 軟件分析結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0 進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠的一般情況 實驗過程中發(fā)現(xiàn)，模型組體質(zhì)量有一定下降，隨著飼養(yǎng)時間的延長，數(shù)只裸鼠出現(xiàn)精神漸差，飲食、活動減少等情況?；鼋舛窘M隨著治療時間的延長裸鼠消瘦逐漸明顯，精神、活躍、飲食有一定影響。而健脾益氣組、全方組裸鼠體質(zhì)量較穩(wěn)定，精神、飲食、活動正常。雷帕霉素組裸鼠體質(zhì)量稍有下降，精神、飲食、活動較好。裸鼠實驗過程未出現(xiàn)死亡。

2.2 各組裸鼠腸癌轉(zhuǎn)移情況比較 各組均出現(xiàn)不同程度的轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移最常見部位是淋巴結(jié)，其次是肝、肺、腹膜。模型組、健脾益氣組的總體轉(zhuǎn)移率達90%，化瘀解毒組轉(zhuǎn)移率為70%，全方組轉(zhuǎn)移率為60%，雷帕霉素組轉(zhuǎn)移率為50%，均較模型組低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明化瘀解毒組、全方組有抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的作用。

2.3 各組裸鼠mTOR、p-mTOR 蛋白表達比較 全方組mTOR 蛋白表達稍有下調(diào)，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；健脾益氣、化瘀解毒、全方組p-mTOR 蛋白表達均有不同程度下調(diào)，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；全方組p-mTOR 蛋白下調(diào)明顯，與雷帕霉素組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；說明健脾益氣、化瘀解毒、全方組對mTOR 的磷酸化具有抑制作用，且全方組更優(yōu)，見表1。

表1 各組裸鼠mTOR、p-mTOR 蛋白表達比較（）

表1 各組裸鼠mTOR、p-mTOR 蛋白表達比較（）

注：與模型組比較，△P<0.05，▲P<0.01；與健脾益氣組比較，#P<0.01；與雷帕霉素組比較，*P<0.05，◆P<0.01。

2.4 各組裸鼠S6K1、p-S6K1 蛋白表達比較 各組S6K1蛋白表達無明顯下調(diào)，與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；健脾益氣組p-S6K1 蛋白表達上調(diào)，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），化瘀解毒、全方組p-S6K1 蛋白表達均不同程度下調(diào)，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；全方組p-S6K1 蛋白下調(diào)最明顯，與雷帕霉素組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明化瘀解毒、全方組對S6K1 的磷酸化具有抑制作用，且全方組更優(yōu)，見表2。

表2 各組裸鼠S6K1、p-S6K1 蛋白表達比較 （）

表2 各組裸鼠S6K1、p-S6K1 蛋白表達比較 （）

注：與模型組比較，1）P<0.01；與健脾益氣組比較，2）P<0.01；與化瘀解毒組比較，3）P<0.01；與雷帕霉素組比較，4）P<0.01。

2.5 各組裸鼠4EBP1、p-4EBP1 蛋白表達比較 各組4EBP1 蛋白表達無明顯下調(diào)，與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；健脾益氣組p-4EBP1 表達上調(diào)，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），化瘀解毒、全方組p-4EBP1 蛋白表達均不同程度下調(diào)，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；全方組p-4EBP1 蛋白下調(diào)明顯，與雷帕霉素組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明化瘀解毒、全方組對4EBP1 的磷酸化具有抑制作用，且全方組更優(yōu)，見表3。

表3 各組4EBP1、p-4EBP1 蛋白表達比較（）

表3 各組4EBP1、p-4EBP1 蛋白表達比較（）

注：與模型組比較，1）P<0.01；與健脾益氣組比較，2）P<0.01；與化瘀解毒組比較，3）P<0.01；與雷帕霉素組比較，4）P<0.01。

3 討論

mTOR 是一類非典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶。mTOR 是PI3K 信號、LKB1 信號的主要中間蛋白，系上游的效應(yīng)器及下游的調(diào)節(jié)器[8]，能夠調(diào)控下游靶蛋白S6K 和4EBP1，二者均是蛋白翻譯的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[9]，故mTOR 在細胞G1期向S 期轉(zhuǎn)換過程中起重要調(diào)控作用。

mTOR 信號的激活，可以使腫瘤細胞快速增殖，促進腫瘤相關(guān)蛋白分泌，加速細胞周期，縮短G1 期時程，腫瘤得以迅速發(fā)生發(fā)展。若mTOR 被特異性抑制，則細胞周期被阻滯在G1 期，從而誘發(fā)細胞凋亡。mTOR 抑制劑就是通過抑制mTOR 活性，從而阻斷S6K 和4EBP1 的磷酸化和蛋白質(zhì)合成，使細胞周期停滯于G1 期，以達到調(diào)控細胞增殖生長的作用。mTOR 是很多惡性腫瘤臨床靶向治療的分子靶點，在結(jié)直腸癌的治療中也取得了一定療效。

基于“瘀”“毒”“虛”擬定的健脾消癌方，以健脾益氣，化瘀解毒為治法，核心藥物人參、薏苡仁可健脾益氣，重樓、半枝蓮可清熱解毒，莪術(shù)、郁金可活血化瘀，全方配伍，扶正抗癌，標本兼顧[5，6]，在結(jié)直腸癌術(shù)后患者抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中獲得良好療效，但其如何協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用及機制本團隊一直在探索。本研究發(fā)現(xiàn)健脾消癌方全方組、化瘀解毒組能降低腸癌轉(zhuǎn)移率，對mTOR 信號通路中關(guān)鍵蛋白p-mTOR、p-S6K1、p-4EBP1 的表達均具有一定的抑制作用，全方組的療效優(yōu)于化瘀解毒組，提示健脾消癌方有可能是通過抑制mTOR 信號通路的激活發(fā)揮抗結(jié)腸癌及抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移作用，其抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用主要由化瘀解毒藥物發(fā)揮，健脾益氣藥物雖不直接發(fā)揮腫瘤轉(zhuǎn)移作用但能協(xié)同提高療效。

現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)[10]清熱解毒中藥有良好的抗結(jié)直腸癌作用，具有抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡、調(diào)控細胞內(nèi)信號通路等作用。重樓、半枝蓮具有抗腫瘤作用，抑制腫瘤血管生長、誘導細胞凋亡、調(diào)節(jié)機體免疫功能等是其抗腫瘤的作用機制[11，12]?；钛鲋兴幉煌煞终{(diào)控的靶點參與腫瘤轉(zhuǎn)移的不同過程，對腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)揮促進或抑制的正反調(diào)控作用[13]。莪術(shù)揮發(fā)油的主要有效成分為姜黃素、β-欖香烯、莪術(shù)醇、莪術(shù)二酮等，通過選擇性調(diào)控某些基因的表達來抑制腫瘤細胞增殖，或誘導凋亡，從而達到抗腫瘤的目的[14，15]。郁金通過抑制腫瘤血管生成、阻斷腫瘤細胞信號通路、誘導腫瘤細胞凋亡等發(fā)揮抗腫瘤作用[16]。本方中莪術(shù)、郁金對腫瘤轉(zhuǎn)移均屬于抑制作用，配合清熱解毒藥物抗腫瘤作用，是本方化瘀解毒組抗腫瘤及抑制轉(zhuǎn)移的主要原因。

《外證醫(yī)案匯編》言：“正氣虛則成巖”?！毒霸廊珪しe聚》曰：“脾腎不足及虛弱失調(diào)之人，多有積聚之病”，提示腫瘤疾病的本質(zhì)乃正氣虧虛。腸道由小腸及大腸組成，小腸受盛化物、大腸傳化糟粕，均與脾胃密切相關(guān)。脾胃為后天之本，滋養(yǎng)五臟，故脾胃健則五臟養(yǎng)，正氣復(fù)?；鼋舛舅幬锖疀?、辛散，久用易損傷脾胃、耗散氣血，傷及正氣[17，18]，故在腸癌抗腫瘤過程中需時時注意健脾益氣。健脾消癌方以化瘀解毒藥物抑制腫瘤、抑制轉(zhuǎn)移，配合健脾益氣藥物，扶正調(diào)理臟腑，抗癌不傷正，可減輕化瘀解毒藥物傷正的弊端，故全方配伍能抑制腸癌生長及轉(zhuǎn)移，療效最佳。