陳傳珍，盧海林，覃 曉

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血管外科，南寧 530021）

血管鈣化是指鈣鹽沉積在動脈壁組織的一種病理改變，可導致血管彈性的喪失和血管僵硬，是心血管疾病發(fā)展的病理基礎[1-3]。據報道，在65歲以上的人群中，約40%的死亡是由心血管疾病引起的[4]。血管鈣化既往被認為是一個被動的、不可避免的病理過程。然而，最近的研究結果表明，從血管平滑肌細胞（VSMCs）表型到成骨細胞表型的轉變是血管鈣化發(fā)生的主要原因[5]，血管鈣化是一個主動的、受調控的過程，與骨和軟骨形成類似[6-7]。盡管血管鈣化的分子機制已經有很多研究，但仍缺乏有效的預防和治療方法。因此，迫切需要進一步探尋血管鈣化的分子機制和治療靶點。

MicroRNA（miRNA）是一類由內源基因編碼的長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA，主要參與轉錄后基因表達的調控。miRNA 主要通過與靶基因的3’UTR 結合后抑制其表達[8]，在細胞內發(fā)揮多種重要的調節(jié)作用，可以作為潛在的治療目標和診斷生物標志物[9-10]。大量miRNAs 在血管疾病中發(fā)揮著重要作用。miR-204/miR-211 通過調節(jié)BMP2 減輕血管鈣化[11]。miR-34a 通過調節(jié)SIRT1促進血管鈣化[12]。同時，在動脈粥樣硬化的血管內皮細胞中發(fā)現了低表達的Let-7b-5p[13]。有研究表明，在平滑肌細胞中通過抑制Let-7b-5p通過上調電子轉移黃素蛋白A（ETFA）表達促進維生素D 受體的積累，從而阻止多裂肌功能障礙的發(fā)展[14]，維生素D介導的成骨細胞因子Runx2表達調控是血管鈣化的必需條件[15-16]。但Let-7b-5p是否能夠逆轉VSMCs表型轉化，減少鈣磷沉淀而抑制血管鈣化進展目前國內外尚無文獻報道。因此，本研究通過高磷誘導VSMCs 鈣化，觀察Let-7b-5p 對VSMCs 鈣化程度和表型轉化相關蛋白的影響，并探討Let-7b-5p 對ETFA的靶向調控作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) VSMCs購自中國科學院昆明細胞庫。VSMCs 用含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)基。

1.2 分組、鈣化模型的建立及轉染 將VSMCs 分為8 組：正常對照組、鈣化組、Let-7b-5p mimic 組、mimic control 組、Let-7b-5p inhibitor 組、inhibitor control 組、ETFA-siRNA 組和siRNA-Control 組。正常對照組用普通DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，不予任何干預，其他各組用含有10 mmol/L β-甘油磷酸鈉（β-GP）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)VSMCs 14 d誘導細胞鈣化。造模14 d 后，按照轉染試劑Lipo 8000（上海碧云天公司）說明書的步驟，分別轉染Let-7b-5p mimic、let-7b-5p inhibitor、ETFA siRNA 及相應的陰性對照（廣州瑞博公司）。

1.3 茜素紅染色檢測VSMCs鈣化情況 取對數生長期的VSMCs 按1×105個/mL 密度接種于6 孔板中，PBS 洗滌后，加入4%多聚甲醛室溫下固定10 min；棄去多聚甲醛溶液，用PBS 洗滌細胞，加入1%茜素紅溶液（pH=4.2）對細胞進行染色10 min，倒置顯微鏡下觀察鈣鹽沉積情況（鈣沉積陽性細胞呈紫紅色），拍照，用Image J軟件分析陽性染色面積所占百分比。

1.4 堿性磷酸酶（ALP）染色觀察VSMCs成骨分化取對數生長期的VSMCs按1×105個/mL密度接種于6 孔板中，PBS 洗滌后，加入4%多聚甲醛室溫下固定10 min；棄去多聚甲醛溶液，PBS 洗滌3 次，加入適量ALP 染色液（碧云天），染色30 min 后，在光學顯微鏡下觀察VSMCs 成骨分化情況（陽性結果為胞質內出現灰褐色至深黑色顆粒狀或片狀沉淀）、拍照，Image J軟件分析陽性染色面積所占百分比。

1.5 細胞ALP活性檢測 取對數生長期的VSMCs按1×105個/mL密度接種于6孔板中，PBS清洗3次，加入100 μL 細胞裂解液進行細胞裂解，離心，取上清；加入ALP 檢測試劑盒工作液，用槍頭輕輕吹打混勻，37 ℃孵育10 min，用酶標儀檢測405 nm 波長處的吸光度值。

1.6 RT-qPCR法檢測Let-7b-5p、Runx2、ETFAmRNA相對表達量 轉染48 h后，用NucleoZOL RNA提取試劑提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，使用ABI 7500型PCR儀進行PCR反應，反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火、延伸30 s，共40 個循環(huán)。引物由廣州復能基因公司設計并合成。引物序列如下：Runx2 上游：5’-CATGGCCGGGAATGATGAG-3’，下游：5’-TGTGAAGACCGTTA-TGGTCAAAGTG-3’；ETFA 上游：5’-CAGCAGCAAGTGGAGGTAGT-3’，下游：5’-CCAGTTAGCTCTGGTCGGTC-3’；β-actin 上游：5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游：5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’；Let-7b-5p 上游：5’-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3’，下游：5’-TGCTTGAGGTAGTAGGTTG-3’。ETFA 和Runx2 的表達以β-actin 為內參，Let-7b-5p 的表達以U6 為內參，用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.7 Western blotting 法檢測Runx2 和ETFA 蛋白表達量 使用RIPA 裂解液裂解VSMCs，提取細胞蛋白，BCA 法測定蛋白濃度；每組取20 μg 蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉移至PVDF膜；室溫封閉1 h，加入一抗Runx2（Abcom-236639，1∶5 000）、ETFA（Proteintech-12262-1-AP，1∶1 000）、GAPDH（Proteintech-13937-1-AP，1∶1 000）4 ℃孵育過夜，PBST 洗膜；加入相應的二抗（Proteintech-SA00001-2，1∶5 000）室溫孵育1 h，PBST洗膜；ECL發(fā)光液顯色、曝光。用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達量。

1.8 雙熒光素酶實驗 利用在線公共數據庫RNA22（https://cm.jefferson.edu/rna22/）檢索Let-7b-5p與ETFA結合位點。為了確定Let-7b-5p與ETFA之間的靶向關系，在HEK293T 細胞中轉染野生型（WT）ETFA 3’-UTR或突變型（MUT）ETFA 3’-UTR和Let-7b-5p mimic 或相應陰性對照（NC）。使用熒光素酶活性檢測試劑盒測定細胞螢火蟲熒光素酶的活性，以海腎熒光素酶的熒光值為標準。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用Graph Pad 軟件分析數據，計量資料以均數±標準差()表示。多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；Pearson相關分析法分析ETFA 與Let-7b-5p、Runx2 表達的相關關系，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 VSMCs 鈣化情況 與正常對照組比較，鈣化組VSMCs 出現大量的紫紅色鈣結節(jié)及大量的藍黑色硫化鈷沉淀（P＜0.001），即鈣化程度和成骨分化程度增加，見圖1。

圖1 VSMCs茜素紅染色（A）和ALP染色（B）結果

2.2 Let-7b-5p 和ETFA 參與VSMCs 的鈣化 與正常對照組比較，鈣化組Runx2 和ETFA mRNA 相對表達量顯著升高，Let-7b-5p 表達顯著降低（均P＜0.01），見圖2A、2B、2C。Pearson相關分析顯示：ETFA 與Let-7b-5p 表達呈負相關關系（r=-0.785，P＜0.001），ETFA與Runx2表達呈正相關關系（r=0.962，P＜0.001），見圖2D、2E。

圖2 正常對照組與鈣化組Runx2、ETFA和Let-7b-5p的表達比較

2.3 Let-7b-5p 可調節(jié)ETFA 和Runx2 的表達 與mimic control 組比較，Let-7b-5p mimic 組Runx2 和ETFA mRNA 及蛋白相對表達量顯著降低，ALP 活性降低（均P＜0.05）；與inhibitor control組比較，Let-7b-5p inhibitor組Runx2和ETFA mRNA及蛋白相對表達量顯著升高，ALP活性升高（均P＜0.05），見圖3。

圖3 Let-7b-5p對VSMCs中ETFA和Runx2的調節(jié)作用

2.4 Let-7b-5p靶向調控ETFA的表達 通過RNA22在線數據庫預測顯示，Let-7b-5p與ETFA 3’-UTR第80～104 位的堿基存在互補結合位點，見圖4A。通過雙熒光素酶實驗驗證Let-7b-5P 是否能夠調節(jié)ETFA的表達。Let-7b-5p mimic組與NC mimic組熒光素酶活性比較無明顯差異（P＞0.05）；與ETFAWT+NC mimic 組比較，與ETFA-WT+Let-7b-5p mimic 組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；與ETFA-WT+Let-7b-5p mimic 組比較，ETFA-MUT+Let-7b-5p mimic 組熒光素酶活性顯著升高（P＜0.05），見圖4B。

圖4 Let-7b-5p對ETFA的靶向調控作用

2.5 沉默ETFA 可減輕VSMCs 的鈣化與siRNAControl 組比較，ETFA-siRNA 組VSMCs 中ETFA 和Runx2 mRNA相對表達量顯著下降（均P＜0.01），紫紅色鈣結節(jié)明顯減少，見圖5。

圖5 沉默ETFA后ETFA、Runx2的表達及茜素紅染色

3 討論

血管鈣化是心血管疾病的風險預測因子和常見病理變化，與高血壓、糖尿病、慢性腎病和衰老等密切相關。血管鈣化包括血管內膜鈣化和中層鈣化。內膜鈣化主要是由血管的慢性炎癥引起的，導致動脈粥樣硬化斑塊。中層鈣化主要指VSMCs 向成骨細胞表型轉變的過程，這是一個主動的、受到調控的過程。目前認為，血管中層的VSMCs 向成骨細胞表型轉變是導致血管鈣化的重要因素[2]。這種細胞表型的轉變使血管平滑肌標志物（SM22α和SMα-肌動蛋白）減少，骨形成標志物（Runx2 和ALP）增加[7,17]。

最新的證據表明，miRNAs參與靶基因的表達，在血管鈣化過程中發(fā)揮著重要作用。有研究表明，Let-7b-5p可以抑制血管內皮細胞增殖和遷移，促進血管內皮細胞的凋亡[13]。電子轉移黃素蛋白（ETF）是一種酶，參與氧化呼吸鏈過程，與脂肪酸代謝等有關[18]，影響線粒體脂酰輔酶A的積累，在脂類疾病中發(fā)揮重要作用。人類ETF由兩個獨立的基因ETFA和ETFB分別編碼。ETFA與細胞凋亡有關。在發(fā)生凋亡的肝細胞中發(fā)現大量的ETFA蛋白[19]。本研究用10 mmol/L β-GP 誘導VSMCs 鈣化，茜素紅染色發(fā)現干預后的VSMCs 出現大量的紫紅色鈣結節(jié)，表明高磷誘導的VSMCs鈣化程度增加。

ALP是成骨細胞的表型標志物之一，可反映成骨細胞的增殖活性。ALP 不僅能促進VSMCs 表型分化，而且可通過水解磷酸酯提高磷酸鹽濃度，水解焦磷酸鹽増加磷酸鈣的生成，最終加速血管鈣化發(fā)展。本研究中，鈣化組VSMCs 成骨分化程度（ALP 陽性染色面積）明顯增加，成骨細胞因子Runx2表達上調，ETFA表達上調，而Let-7b-5p表達下調；相關性分析顯示，Let-7b-5p表達與ETFA呈負相關關系，Runx2 表達與ETFA 呈正相關關系；轉染Let-7b-5p mimic 后，Runx2 和ETFA mRNA 和蛋白表達明顯下調，ALP活性降低，而Let-7b-5p inhibitor的作用相反；雙熒光素酶實驗證明了Let-7b-5p可靶向抑制ETFA 的表達。以上結果說明，Let-7b-5p 可通過抑制ETFA 表達減輕VSMCs 的成骨分化。此外，沉默ETFA 后，Runx2 和ETFA mRNA 和蛋白表達明顯下調，茜素紅染色顯示細胞鈣結節(jié)明顯減少，與Let-7b-5p mimic 的作用相一致。表明沉默ETFA表達能抑制血管鈣化。

綜上所述，Let-7b-5p 和ETFA 參與血管鈣化過程，Let-7b-5p 可通過下調ETFA 的表達抑制高磷誘導的VSMCs 鈣化。本課題組下一步將研究ETFA是否通過VDR 通路或者其他途徑來發(fā)揮抗血管鈣化的作用，以期完善血管鈣化的分子調控機制和提供血管鈣化的靶向基因治療選擇。