陳 明,許志華,曾曉聰

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，南寧 530021)

Klotho 是1997 年Kuro-o 等發(fā)現(xiàn)的一種哺乳動物抗衰老基因[1]，大多數(shù)表達(dá)于腎臟遠(yuǎn)曲小管和大腦脈絡(luò)膜叢。其在細(xì)胞內(nèi)分別有膜結(jié)合型Klotho（α-Klotho）、可溶型Klotho（β-Klotho）和分泌型Klotho（γ-Klotho）3種形式蛋白[2-3]。膜結(jié)合型Klotho（α-Klotho）主要通過介導(dǎo)骨分泌激素纖維母細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor,FGF）23的活性來調(diào)節(jié)鈣磷離子。而分泌型Klotho 和可溶型Klotho 主要作為激素釋放到體液靶向作用于細(xì)胞，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、能量代謝和抗炎癥等作用[4]。有研究報道，Klotho 表達(dá)的降低通過促進(jìn)M1 型極化加速了糖尿病腎病的進(jìn)展[5]，表明Klotho 可能存在對巨噬細(xì)胞極化調(diào)控。

巨噬細(xì)胞在遭遇宿主的感染時會在功能上極化為M1 和M2 巨噬細(xì)胞。在體外實驗中，M1 型巨噬細(xì)胞由脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）和干擾素-γ（interferon-γ,IFN-γ）誘導(dǎo)，M2 巨噬細(xì)胞常用白細(xì)胞介素4（interleukin-4,IL-4）誘導(dǎo)[6]。每種巨噬細(xì)胞表型都具有特定生物標(biāo)志物定義,M1 型標(biāo)志物有一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）和CD86[7]。M1 亞型巨噬細(xì)胞分泌大量的促炎反應(yīng)因子，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα,TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1 beta,IL-1β），這些炎癥因子會抑制組織再生和傷口修復(fù)。M2 表型的標(biāo)志物包括CD206、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10,IL-10）、精氨酸酶1（arginase 1,Arg-1），具有促進(jìn)組織修復(fù)、血管生成和抗炎等多重作用[8]。因此，在炎癥的發(fā)展中如何調(diào)控M1 和M2 型巨噬細(xì)胞之間平衡顯得尤為重要。本研究主要探討Klotho 對骨髓來源M1 型巨噬細(xì)胞向M2 型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變的影響，從而為Klotho在臨床治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、試劑和主要儀器

從廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心購買無特定病原體（specific pathogen free,SPF）6 周齡C57BL/6J小鼠（許可證號：SYXK 2014-0003）；重組Klotho 蛋白（R&D 公司）；F4/80、CD11b 流式抗體（BD 公司）；DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（美國Gibco 公司）；iNOS 單克隆抗體、TNF-α 單克隆抗體和Arg-1 多克隆抗體（美國cell signaling Technology 公司）；巨噬細(xì)胞集落刺激因子M-CSF（美國PeproTech 公司）；脂多糖LPS（sigma 公司）；全套RT-PCR 試劑（日本TaKaRa 公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo,美國）；FACSCantoII 流式細(xì)胞儀（BD,美國）；酶標(biāo)儀購于美國Thermo Fisher Scientific 公司；Odyssey 雙色紅外熒光成像系統(tǒng)購于美國LI-COR公司。

1.2 骨髓來源巨噬細(xì)胞培養(yǎng)

取若干只6 周齡左右雄性小鼠，1.25%阿佛丁0.5 mL麻醉后脫頸處死，在細(xì)胞超凈臺上剝離小鼠的股骨和脛骨，酒精燈旁用PBS反復(fù)沖洗骨髓腔至骨質(zhì)透亮，收集沖洗液經(jīng)100 μm 細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，于4 ℃，離心7 min得細(xì)胞沉淀，然后在細(xì)胞沉淀中加入3 mL 紅細(xì)胞裂解液，混勻冰上靜置10 min，然后加入20 mL PBS 液重懸，離心棄上清液，重新10 mL PBS 洗滌1 次，離心。加入含有30 ng/mL MCSF 培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)鋪于6 孔板。3 d 后換液加濃度為30 ng/mL M-CSF 的DMEM 低糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 d后進(jìn)行實驗。

1.3 細(xì)胞免疫熒光鑒定BMDMs 并檢測TNF-α 和Arg1蛋白表達(dá)

收集細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定15 min，結(jié)束后用PBST 洗滌。然后8%左右的山羊血清封閉2 h，孵育F4/80（1∶100）、CD11b（1∶100）、TNF-α（1∶200）、Arg-1(1∶200) 4 度過夜，次日PBS 清洗完后室溫避光孵育熒光二抗（1∶200），最后滴加DAPI 1～2 滴，倒置熒光顯微鏡觀察熒光并拍照。

1.4 細(xì)胞流式術(shù)驗證骨髓來源巨噬細(xì)胞

收集細(xì)胞，取100 萬左右細(xì)胞置于流式管中，100 μL PBS重懸，設(shè)立陰性管，單陽管，各管分別加入0.5 μL PE-F4/80、PE/Cy5-CD11b流式抗體進(jìn)行單標(biāo)和雙標(biāo)，避光孵育40 min。300 μL PBS 重懸上機(jī)檢測。

1.5 骨髓來源性巨噬細(xì)胞干預(yù)和分組

將BMDMs 細(xì)胞分成空白組、LPS 組、LPS+Klotho組，分別對各組進(jìn)行相應(yīng)處理。空白組：普通培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h 后換新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)42 h；LPS組：含LPS（100 ng/mL）的培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，后換成普通血清培養(yǎng)基培養(yǎng)42 h；LPS+Klotho 組，用含LPS（100 ng/mL）的血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，后換成含有1 μg/mL Klotho 蛋白培養(yǎng)基培養(yǎng)42 h。上述各組細(xì)胞分別收集細(xì)胞進(jìn)行檢驗。

1.6 RT-qPCR檢測IL-10、IL-6、IL-1β、iNOS和Arg-1 mRNA含量

RNA 提取：收集細(xì)胞，6 孔板每孔加入1 mL 的RNA 裂解液，收集裂解液并且加入0.2 mL 氯仿，充分震蕩成乳白色后靜置5 min，在離心機(jī)12 000×g離心15 min 完后液體分成3 層，小心吸取上層溶液轉(zhuǎn)移新的離心管并加入1 mL異丙醇，上下混勻靜置10 min，然后12 000×g 離心10 min 得RNA 沉淀，1 mL 70%乙醇清洗RNA 沉淀，最后在用20 μL DEPC 水溶解總RNA。RNA 的濃度值和純度用紫外分光光度計測量，濃度在500～800 ng/μL，OD260/OD280 在1.8～2.0 之間。逆轉(zhuǎn)錄：用逆轉(zhuǎn)錄試劑將1 000 ng RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄cDNA。RT-qPCR：按說明書設(shè)定PCR 上機(jī)參數(shù)，預(yù)變性（95 ℃，30 s），變性（95 ℃，5 s），退火（60 ℃，31 s），40個循環(huán)。2-ΔΔCt法分析樣本mRNA 含量。選用內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行校準(zhǔn)。每個實驗組設(shè)計4 復(fù)孔，引物均由生工公司設(shè)計合成。引物序列如下：IL-10 正向5’-CAAGGCAGTGGAGCAGGTGAAG-3’，反向5’-CGCTTTGGTGAGTAGACAGAGGTC-3’；IL-6 正向5’-CTT-CTTGGGACTGATGCTGGTGAC-3’,反向5’-TCTGTTGGGAGTGGTATCCTCTGTG-3’；IL-1β 正向5’-AGCTTCAGGCAGGCAGTATC-3’，反向5’-TCATC-TCGGAGCTGTAGTG-3’;iNOS正向5’-ATCTTGGAGCGAGTTGTGGATTGTC-3’，反向5’-TAGGTGAGGGCTTGGCTGAGTG-3’;Arg-1 正向5’-AGACAGCAGAGGAGGTGAAGAGTAC-3’，反向5’-AAGGTAGTCAGTCCCTGGCTTATGG-3’；GAPDH 正向5’-AGAACATCATCCCTGCCTCTACT-3’,反向5’-GATGTCATCATATTTGGCAGGTT-3’。

1.7 Western blotting 檢測iNOS 和Arg-1 蛋白表達(dá)水平

收集細(xì)胞，在冰上加入RIPA（含1%PMSF）裂解液提取BMDMs 總蛋白，離心取上層清液，制作BCA標(biāo)準(zhǔn)曲線并測樣本蛋白溶度，15孔板每孔上樣量35 μg 蛋白進(jìn)行電泳分離，電泳結(jié)束轉(zhuǎn)移PDVF（0.45 μm）上轉(zhuǎn)膜（100 V，80 min），結(jié)束后快速封閉液封閉15 min，孵育Arg-1（1∶1 000）、iNOS（1∶1 000）4 ℃過夜。次日TBST洗滌液清洗3次，每次15 min，孵育熒光二抗（1∶15 000）室溫?fù)u床45 min，用雙色紅外激光成像系統(tǒng)顯影，重復(fù)4 次，采用GAPDH 作為內(nèi)參，用Image J 軟件對蛋白灰度值分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7 分析數(shù)據(jù)，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓來源性巨噬細(xì)胞形態(tài)與鑒定

免疫熒光顯示，大多數(shù)細(xì)胞都是CD11b（綠色）和F4/80（紅色）雙陽性細(xì)胞，細(xì)胞呈現(xiàn)不同的多邊形不規(guī)則形態(tài)（圖1A）；細(xì)胞流式結(jié)果顯示，用MCSF 刺激因子誘導(dǎo)的骨髓來源性巨噬細(xì)胞高表達(dá)F4/80 和CD11b,雙陽性細(xì)胞占總的細(xì)胞數(shù)目的98.4%（圖1B）；普通光鏡下觀看到誘導(dǎo)成熟骨髓來源性巨噬細(xì)胞形態(tài)，呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)（圖1C）。

圖1 骨髓來源性巨噬細(xì)胞的鑒定和形態(tài)

2.2 巨噬細(xì)胞極化相關(guān)分子mRNA 及相關(guān)蛋白表達(dá)

RT-qPCR 結(jié)果顯示，LPS 組的IL-1β、iNOS、IL-6 mRNA 表達(dá)量高于空白組（P＜0.001）。而與LPS組相比，LPS+Klotho 組Arg-1 和IL-10 的mRNA 表達(dá)量顯著增高，iNOS、IL-1β 和IL-6 mRNA 降低（P＜0.001）。與空白組相比，LPS組高表達(dá)iNOS蛋白，低表達(dá)Arg-1 蛋白；與LPS 組比較，LPS+Klotho組Arg-1 蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.001），iNOS 蛋白表達(dá)降低（P＜0.001），見圖2。

圖2 3組骨髓來源性巨噬細(xì)胞分型相關(guān)分子mRNA和蛋白表達(dá)情況

2.3 TNF-α和Arg-1蛋白免疫熒光

與空白組相比，LPS 組高表達(dá)TNF-α（綠色）。與LPS組相比，LPS+Klotho組降低TNF-α（綠色）的含量，顯著提高Arg-1（紅色）的表達(dá)，見圖3。

圖3 3組骨髓來源性巨噬細(xì)胞TNF-α和Arg-1蛋白表達(dá)情況

3 討論

炎癥反應(yīng)在生物體內(nèi)有利有弊，適度的炎癥可以幫助機(jī)體防御病毒和細(xì)菌，但過度的炎癥造成組織損傷。有相關(guān)研究表明，巨噬細(xì)胞極化在心血管疾病中產(chǎn)生巨大影響[9-11]。IKKɑ在LPS刺激后調(diào)節(jié)MEK1/2-ERK1/2 和下游p65 信號級聯(lián)，通過負(fù)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化到M1 表型來防止心肌I/R 損傷的發(fā)展[12]。MSC-Exo 通過miR-182 調(diào)控toll 樣受體4（TLR4）改變巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)從而減輕小鼠的心肌I/R損傷[12]。在整個炎癥的發(fā)生發(fā)展中，決定巨噬細(xì)胞的極化方向因子很多，比如細(xì)胞內(nèi)的傳導(dǎo)信號通路和刺激因子。而巨噬細(xì)胞的亞型處于一個動態(tài)平衡，最終決定炎癥的方向是巨噬細(xì)胞向哪一個方向極化。細(xì)菌性脂多糖是一種用來誘導(dǎo)炎癥的革蘭陰性菌的毒素，能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M0向M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變，同時促進(jìn)細(xì)胞因子IL-6、TNF-α 的分泌，以及提高iNOS蛋白的表達(dá)，常用來建立細(xì)胞炎癥模型[13]。在炎癥發(fā)展的最初階段，主要是以M1型巨噬細(xì)胞為主，但是隨著炎癥的進(jìn)展，機(jī)體內(nèi)巨噬細(xì)胞會由M1 型巨噬細(xì)胞會轉(zhuǎn)換成M2 型巨噬細(xì)胞，進(jìn)而對機(jī)體進(jìn)行修復(fù)。所以，在炎癥發(fā)展的過程中，如何讓M1 型巨噬細(xì)胞加快結(jié)束，促進(jìn)M2 型巨噬細(xì)胞的提前到來成為了現(xiàn)今的研究方向。但是，最新的研究顯示，M1型巨噬細(xì)胞在體內(nèi)很難向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變[14]。所以，如何在疾病炎癥中平衡巨噬細(xì)胞M1/M2的表型又成為今后的研究熱點。

關(guān)于Klotho 是否影響骨髓來源性巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的研究尚不多見。因此，本研究采用巨噬細(xì)胞集落刺激因子M-CSF 將小鼠骨髓干細(xì)胞誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞M0，并對其進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞免疫熒光雙重鑒定，證實了誘導(dǎo)分離的是骨髓來源性巨噬細(xì)胞，符合國際巨噬細(xì)胞指南[15]。首先用脂多糖（LPS）刺激M0巨噬細(xì)胞成為M1型巨噬細(xì)胞，然后用重組Klotho蛋白對M1型巨噬細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。本研究結(jié)果顯示，LPS 顯著上調(diào)骨髓來源性巨噬細(xì)胞M0的TNF-α、IL-6、iNOS表達(dá)，提示誘導(dǎo)M0巨噬細(xì)胞成M1型巨噬細(xì)胞。但是進(jìn)行Klotho干預(yù)后，M1型標(biāo)志物iNOS 和TNF-α 表達(dá)降低。M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物IL-10、Arg1 蛋白明顯增高，證實了Klotho可抑制LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1 型極化，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 型轉(zhuǎn)換，但是具體的調(diào)控方式還需要進(jìn)一步研究。最近關(guān)于Klotho 在炎癥相關(guān)疾病的研究很多，有研究表明，炎癥因子TWEAK和TNF-α減低了腎臟Klotho 的表達(dá)[16]，與本文研究結(jié)果一致。除此之外，Klotho除了抗衰老，還具有特別廣泛的功能，包括抗氧化損傷、細(xì)胞凋亡、礦物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)、纖維化和高血壓等[3,17-21]，具有廣泛的研究前景。

綜上所述，Klotho蛋白能夠抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化，促進(jìn)向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變，為Klotho治療心血管疾病提供了體外理論上的支持。