鐘芳芳，楊友，郭鈴，劉靜，曾艷，馬文哲，劉文君

(1.澳門科技大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，澳門 999078;2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科·四川省出生缺陷臨床醫(yī)學(xué)研究中心·出生缺陷及兒童血液腫瘤實(shí)驗(yàn)室，四川 瀘州 646000；3.澳門科技大學(xué)中藥質(zhì)量研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，澳門 999078)

過敏性紫癜(henoch-sehtlnlein purpura，HSP)以特征性皮損，常累及關(guān)節(jié)、胃腸道、腎臟等臟器為主要表現(xiàn)，是兒童時(shí)期最常見的小血管炎疾病[1-3]。紫癜性腎炎(henoch-schonlein purpura nephritis，HSPN)指HSP患兒出現(xiàn)腎臟損害，是影響過敏性紫癜遠(yuǎn)期預(yù)后并導(dǎo)致患兒死亡的主要原因[4-6]。目前，HSP的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，但機(jī)制仍不清楚?，F(xiàn)有證據(jù)[7-9]表明，感染和遺傳因素是HSP發(fā)病的兩個(gè)重要因素。IL-17是深度參與了機(jī)體炎癥和免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子，近年各類免疫性和感染性疾病的易感性與IL-17基因多態(tài)性的關(guān)系是研究的熱點(diǎn)。目前，已有川崎病、支氣管哮喘、炎癥性腸病等免疫性疾病的易感性與IL-17A基因多態(tài)性相關(guān)的報(bào)告[10-12]。本課題組既往研究也發(fā)現(xiàn)，IL-17A的-692C/T、-197G/A兩個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性與兒童川崎病、兒童哮喘等風(fēng)濕免疫性疾病易感性相關(guān)。還有研究[13]表明，相同的基因多態(tài)性可以通過共通的致病通路導(dǎo)致不同的免疫相關(guān)性疾病的發(fā)生。本研究旨在通過分析IL-17基因(-197G/A、-692C/T)基因型分布頻率，揭示IL-17A這兩個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性與兒童過敏性紫癜易感性及腎臟損害的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年12月至2019年11月西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院門診隨訪及住院的380例HSP患兒(HSP組)及同地區(qū)同時(shí)間段405名健康兒童(對照組)為研究對象。HSP組中，男性202例，女性178例，平均年齡(7.2±2.1)歲。對照組中，男性216名，女性189名，平均年齡(6.9±2.3)歲。HSP組依據(jù)有無腎臟損傷分為紫癜性腎炎組(HSPN組，n=115)和非紫癜性腎炎組(非HSPN組，n=265)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)HSP符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》關(guān)于兒童過敏性紫癜的診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]；(2)年齡<14歲；(3)近期無發(fā)熱感染病史；(4)患兒家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及引物合成 采用DNA提取試劑盒(天根生物,中國)通過每例入選對象的外周靜脈血提取人基因組DNA；由上海生工公司合成根據(jù)已知人基因序列、IL-17A兩位點(diǎn)的SNPs和相應(yīng)的引物設(shè)計(jì)原則自行設(shè)計(jì)兩位點(diǎn)的序列特異性引物。見表1。

1.2.2 SSP-PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系分別由2 μL模板DNA，0.5 μL特異性引物F1(或F2)，0.5 μL內(nèi)參正向C，8.5 μL通用反向引物，12.5 μL 2×Power Taq Master Mix組成，最后由8.5 μL ddH2O補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；然后進(jìn)入35各循環(huán)，94 ℃變性30 s，退火(溫度見表1)40 s，72 ℃延伸40 min；最后72 ℃再延伸5 min。

1.2.3 SSP-PCR產(chǎn)物電泳 配制1.5%瓊脂糖凝膠，每個(gè)樣孔中加入5 μLPCR產(chǎn)物，將凝膠放入電泳儀(0.5×TAE緩沖液)中電泳35 min(電壓110 V，室溫)后，用自動(dòng)凝膠成像儀(基因公司,英國)里查看凝膠電泳圖譜。見圖1。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測序 為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用的SSP-PCR法檢測的準(zhǔn)確性和可靠性，將經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)初步確定了IL-17A基因兩個(gè)位點(diǎn)基因型的樣本隨機(jī)各選取3份，應(yīng)用內(nèi)參引物(C，R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物送至上海生工公司進(jìn)行DNA測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與處理。應(yīng)用直接計(jì)數(shù)法表示兩位點(diǎn)基因型和等位基因，兩組間差異采用χ2檢驗(yàn)；應(yīng)用優(yōu)勢比(OR)評估相對危險(xiǎn)度，并計(jì)算95%可信區(qū)間(CI)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 遺傳平衡檢驗(yàn)

Hardy-Weinbergy遺傳平衡定律檢驗(yàn)顯示，HSP組和健康對照組在IL-17A這兩個(gè)位點(diǎn)的基因型分布頻率均達(dá)到遺傳平衡(P>0.05)，說明實(shí)驗(yàn)的入選對象具有群體代表性。見表2。

表2 IL-17A各基因型分布頻率的Hardy-Weinbergy遺傳平衡檢驗(yàn)[n(%)，n=405]

2.2 PCR產(chǎn)物測序分析

將隨機(jī)選取的樣本IL-17A兩個(gè)位點(diǎn)的測序結(jié)果與SSP-PCR檢測的同一樣本的結(jié)果進(jìn)行比對，兩者顯示的SNP位點(diǎn)的基因型是一致的，證明本研究應(yīng)用SSP-PCR檢測的結(jié)果是準(zhǔn)確可信的，方法是可行的。

2.3 HSP組與對照組IL-17A-692C/T、-197G/A位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率比較

HSP組和對照組IL17A-692C/T位點(diǎn)基因型和等位基因的分布頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而IL-17A -197G/A位點(diǎn)的基因型及等位基因的分布頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。THSP組T基因型分布頻率及等位基因T的分布頻率高于對照組(P<0.05)。HSPN組和非HSPN組IL-17A(-197G/A、-692C/T)的基因型和等位基因分布頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3及表4。

表3 HSP組和對照組IL-17A基因型和等位基因的分布頻率[n(%)]

表4 HSPN組和非HSPN組IL-17A基因型和等位基因的分布頻率[n(%)]

3 討論

當(dāng)前，過敏性紫癜在兒童中的發(fā)病率越來高，且重癥病例也越來越常見[15]。自200多年前被發(fā)現(xiàn)以來，在世界各地都有HSP發(fā)病報(bào)道，據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年兒童發(fā)病率約8～20/10萬，其中<5歲患兒約占50%[16]?；仡櫺匝芯縖17-19]發(fā)現(xiàn)，HSP患兒中10%～50%有腎臟損害，且約15%有持續(xù)腎臟損害，約8%進(jìn)展至終末期腎病。紫癜性腎炎成為過敏性紫癜患兒死亡的主要原因，所以，是否累積腎臟是評估過敏性紫癜遠(yuǎn)期預(yù)后的最重要指標(biāo)[20]。因此，對過敏性紫癜的發(fā)病機(jī)制和紫癜性腎炎的早期預(yù)測指標(biāo)的研究意義重大，對于易感人群的保護(hù)和早期干預(yù)將創(chuàng)造極大的社會(huì)學(xué)和經(jīng)濟(jì)學(xué)價(jià)值。

目前比較公認(rèn)的是HSP的發(fā)生與感染和機(jī)體的免疫反應(yīng)有關(guān)，認(rèn)為是一種或多種病原侵犯易感者，激活機(jī)體免疫反應(yīng)，從而引起大量炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子釋放，導(dǎo)致瀑布式級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終使全身的血管受損引起臨床癥狀[21]。雖然目前尚未報(bào)道某個(gè)特定的基因與HSP的發(fā)病直接相關(guān)，但是，已報(bào)道了多個(gè)基因的多態(tài)性(C1GALT1基因、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因、血管緊張素原基因等)與HSP的易感性相關(guān)[22-23]。

人體中的IL-17主要是由Th17細(xì)胞產(chǎn)生，同時(shí)在中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、NKT細(xì)胞等多種細(xì)胞中也有少量表達(dá)[24-25]。目前研究[26]發(fā)現(xiàn)，人IL-17家族有6個(gè)成員，而通常所說的IL-17就是特指IL-17A。人體分泌的IL-17與IL-17的受體結(jié)合后通過多條信號(hào)途徑可以促進(jìn)諸如粒細(xì)胞趨化蛋白2、IL-6、IL-8等多種因子的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄[27]。而機(jī)體的多種免疫性、感染性疾病的發(fā)生就是由這些因子的聚集并激活炎癥瀑布反應(yīng)而產(chǎn)生的[28-29]。由此可見，IL-17在免疫性及感染性疾病的發(fā)生中占有重要地位。目前研究[30-31]也發(fā)現(xiàn)，外周血中Th17細(xì)胞和血清中的IL-17在HSP患兒中是明顯升高的。本課題組既往已發(fā)現(xiàn)IL-17A-692C/T、-197G/A基因多態(tài)性與川崎病、兒童哮喘等風(fēng)濕免疫性疾病易感性相關(guān)。本文首次探索IL-17A基因這兩個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性與過敏性紫癜易感性及腎臟損害的關(guān)系。

本研究采用SSP-PCR檢測了四川川南地區(qū)兒童IL-17A基因的兩位點(diǎn)的SNP，通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，在川南地區(qū)漢族兒童中IL17A基因啟動(dòng)子區(qū)-692和-197兩位點(diǎn)存在單核苷酸多態(tài)性；IL-17A基因-692C/T位點(diǎn)三個(gè)基因型CC型，CT型，TT型在川南地區(qū)漢族健康兒童的分布分別是30.1%，55.1%，14.8%，等位基因C占57.7%；這與Gilberto等[32]報(bào)道的在墨西哥人群中該位點(diǎn)的CC型，CT型，TT型分別是5.0%，33.0%，61.0%有明顯的差異，可能與研究所選取的樣本的種族和地區(qū)不同有關(guān)。對比HSP組與對照組發(fā)現(xiàn)，IL-17A基因-692位點(diǎn)的TT基因型、T等位基因的分布頻率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，提示此位點(diǎn)的T等位基因可能是兒童HSP發(fā)病的易感基因，罹患兒童HSP的風(fēng)險(xiǎn)T等位基因攜帶者比C等位基因攜帶者增高。原因可能是啟動(dòng)子區(qū)是控制基因轉(zhuǎn)錄時(shí)間和程度的區(qū)域，-692這個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)位于IL-17A的啟動(dòng)子區(qū)，該位點(diǎn)的等位基因由C突變?yōu)門后可能使IL-17A轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變，從而導(dǎo)致IL-17A蛋白的表達(dá)發(fā)生改變，進(jìn)一步影響過敏性紫癜的發(fā)生發(fā)展。多態(tài)性位點(diǎn)-197G/A的基因型及等位基因的分布頻率在HSP組和對照組中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，提示HSP的易感性可能與-197G/A基因多態(tài)性無相關(guān)性；同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，IL-17A的兩個(gè)基因位點(diǎn)的基因型及等位基因分布在HSPN組和非HSPN組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，提示IL-17A這兩個(gè)位點(diǎn)SNP與過敏性紫癜腎臟損害無關(guān)。本研究針對于兒童HSP易感性的相關(guān)研究數(shù)據(jù)希望能進(jìn)一步豐富兒童過敏性紫癜易感基因生物信息數(shù)據(jù)庫，為能進(jìn)一步尋找到HSP的易感候選基因，以便患病的高風(fēng)險(xiǎn)人群采取早期干預(yù)奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，川南地區(qū)漢族兒童中HSP的易感性與IL-17A -692C/T基因多態(tài)性相關(guān)，攜帶-692位點(diǎn)T等位基因的兒童更易罹患HSP，而IL-17A -197G/A位點(diǎn)多態(tài)性與該地區(qū)兒童HSP的易感性無相關(guān)性，IL-17A兩個(gè)基因的多態(tài)性與兒童HSP腎臟損害亦無相關(guān)性。而-692位的多態(tài)性與IL-17A蛋白的表達(dá)是否相關(guān)，則需要進(jìn)一步進(jìn)行的功能學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)的研究。此外，某個(gè)基因的多態(tài)性在同一族群的不同區(qū)域或者不同族群的同一區(qū)域的分布是不盡相同，那么與疾病的易感性也可能存在差異。因此，將研究對象擴(kuò)展至不同區(qū)域、不同族群進(jìn)行多中心大樣本的采集研究，IL-17A基因多態(tài)性與兒童過敏性紫癜易感性及腎臟損害的關(guān)系才能得到進(jìn)一步的揭示。