梁張岐，李國鴻，黃雅夢，周攀，張一諾，袁青彬

南京工業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，南京 211816

抗生素在養(yǎng)殖和醫(yī)療衛(wèi)生等行業(yè)的過度使用極大加速了抗生素抗性基因的產(chǎn)生及傳播[1-2]，成為威脅公共健康的全球性重大問題[3-4]。抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)，以下簡稱抗性基因，成為一種新型環(huán)境污染物，已在水、大氣和土壤等各種環(huán)境中被檢出[5]，其中城市污水廠是抗性基因的重要儲(chǔ)存庫[6-7]，已有超過數(shù)百種抗性基因被檢出[8]，抗性基因濃度可高達(dá)108copies·L-1[9]。但是受檢測方法的制約[10]，目前大多數(shù)研究僅針對(duì)傳統(tǒng)胞內(nèi)抗性基因(intracellular antibiotic resistance genes, iARGs)，對(duì)胞外抗性基因(extracellular antibiotic resistance genes, eARGs)尚鮮有研究。而越來越多的研究表明，eARGs同樣廣泛存在于環(huán)境中[11-13]。eARGs由細(xì)胞主動(dòng)分泌或死亡后釋放產(chǎn)生[14]，能夠獨(dú)立存活較長時(shí)間而不被降解，并在適宜條件下重新進(jìn)入胞內(nèi)表達(dá)抗藥性，具有同樣嚴(yán)峻卻更加隱蔽的健康風(fēng)險(xiǎn)[15-17]。并且，eARGs可以游離于水中(f-eARGs，游離型)或附著于介質(zhì)(a-eARGs，結(jié)合型)而存在[11]，兩者的生存和傳播能力可能存在顯著差異。如游離型可能傳播能力較強(qiáng)[11]，而結(jié)合型由于附著介質(zhì)的存在可以在環(huán)境中長期存活[18-19]。因此，深入揭示不同類型eARGs的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)對(duì)于細(xì)菌抗藥性的研究至關(guān)重要。

污水廠是eARGs存在的重要場所，其豐度不低于甚至明顯高于iARGs。如Yuan等[10]的報(bào)道表明，污水廠出水f-eARGs豐度占總ARGs的(90.3±16.5)%，是iARGs的10余倍。可以推測，污水生物處理過程中強(qiáng)烈的攪拌、活躍的微生物代謝等條件，可能導(dǎo)致eARGs大量產(chǎn)生。然而目前對(duì)于a-eARGs和f-eARGs在生物處理過程中的產(chǎn)生特征和機(jī)制尚缺乏深入研究。

為了探索上述特征和機(jī)制，本研究建立了序批式活性污泥反應(yīng)器(SBR)，考察啟動(dòng)和運(yùn)行過程中4種典型抗性基因(tetA、sul1、sul2和ermB)在a-eARGs和f-eARGs的時(shí)空變化特征。在此基礎(chǔ)上，重點(diǎn)考察了曝氣強(qiáng)度和污泥負(fù)荷對(duì)a-eARGs和f-eARGs產(chǎn)生和變化的影響。本研究將為揭示污水處理過程中抗性基因的歸趨和風(fēng)險(xiǎn)提供理論和實(shí)驗(yàn)支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 SBR反應(yīng)器的啟動(dòng)和運(yùn)行

采用3個(gè)有機(jī)玻璃材質(zhì)的圓柱形SBR反應(yīng)器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，尺寸均為14 cm×30 cm(Φ×h)。反應(yīng)器進(jìn)水量為3.96 L·d-1，進(jìn)水采用模擬配水，配方如表1所示，活性污泥取自南京市某污水處理廠曝氣池。啟動(dòng)階段，將1.5 L活性污泥和2.5 L配水混勻后加入反應(yīng)器，SBR周期設(shè)置為8 h，通過PLC時(shí)控開關(guān)設(shè)置程序全自動(dòng)運(yùn)行，程序設(shè)置為進(jìn)水0.5 h，攪拌5 h，靜置1 h，出水0.5 h以及閑置排泥1.5 h，一天運(yùn)行3個(gè)周期。每天監(jiān)測混合液懸浮固體濃度(MLSS)和化學(xué)需氧量(COD)，待MLSS維持在3 000～4 000 mg·L-1，COD去除率維持在90%以上時(shí)，認(rèn)為啟動(dòng)完成，整個(gè)啟動(dòng)階段用時(shí)7 d，在第1、4和7天分別取活性污泥混合液10 mL儲(chǔ)存于4 ℃的冰箱中待后續(xù)分析。

穩(wěn)定運(yùn)行后分別考察曝氣強(qiáng)度和污泥負(fù)荷對(duì)2種eARGs產(chǎn)生的影響。對(duì)于曝氣強(qiáng)度，SBR反應(yīng)周期仍維持在8 h，通過調(diào)整曝氣時(shí)間來設(shè)置低(3 h)、中(4 h)和高(5 h)3種水平，厭氧攪拌對(duì)應(yīng)為2、1和0 h，其他時(shí)間設(shè)置不變。對(duì)于污泥負(fù)荷，通過調(diào)整進(jìn)水COD濃度來設(shè)置低(0.1 kg(BOD)·(kg(MLSS)·d)-1)、中(0.2 kg(BOD)·(kg(MLSS)·d)-1)和高(0.3 kg(BOD)·(kg(MLSS)·d)-1)3種水平，其他成分按照比例調(diào)整以維持各元素比值恒定。SBR運(yùn)行期條件和啟動(dòng)期保持一致，反應(yīng)器保持穩(wěn)定運(yùn)行10 d，在第10天分別取出水500 mL和活性污泥10 mL用于后續(xù)分析。

1.2 胞內(nèi)、結(jié)合型和游離型胞外DNA的提取

采用課題組開發(fā)的胞內(nèi)和胞外DNA預(yù)處理方法進(jìn)行胞內(nèi)、結(jié)合型和游離型胞外DNA的分離[10]。首先用0.22 μm碳酸酯濾膜(Millipore，美國)將樣品過濾，將濾液收集用于提取游離型胞外DNA。濾膜用10 mL磷酸鹽緩沖液浸泡，并于渦旋振蕩器室溫震蕩10 min，濾膜和混合液置于新濾膜上再次過濾，濾液收集用于提取結(jié)合型胞外DNA，而2次過濾的濾膜用于提取胞內(nèi)DNA。

胞外DNA采用課題組開發(fā)的磁珠法提取，該方法對(duì)胞外DNA的提取效率高達(dá)85.3%～93.0%[10]。首先將3 mL異丙醇和4 mL的CL buffer(蛋白酶K，在30 mmol·L-1Tris-HCl中20 g·L-1，天根生物科技公司，中國)添加到5 mL的樣品濾液中，并充分混合以去除雜質(zhì)，再加入30 μL的磁珠備用液，顛倒混勻，在快速核酸提取儀渦旋震蕩4 min后，將混合物置于磁力架上以沉淀磁珠并棄去上清液。然后用1 mL的Buffer CW1(含有7 mol·L-1鹽酸胍的50%異丙醇)洗滌磁珠，再次利用磁力架除去上清液。接著用Buffer CW2(75%的乙醇)洗滌2次，在室溫下放置10～15 min使殘余的乙醇充分揮發(fā)。將30 μL的Elution Buffer(pH 8.5，10 mmol·L-1Tris-HCl，預(yù)熱至55 ℃)添加至磁珠中震蕩5 min。最后將混合物置于磁力架上收集上清液用于DNA分析。將獲得的DNA采用Nanodrop和瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

對(duì)于胞內(nèi)DNA的提取，將濾膜剪碎放入DNA提取管中，采用DNA試劑提取盒(FastDNA Spin Kit for Soil試劑盒MpBio，美國)進(jìn)行DNA提取，按照試劑盒操作手冊進(jìn)行提取，將獲得的DNA采用Nanodrop和瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.3 抗性基因的定量檢測

使用LightCycler 96 (Roche，瑞士)進(jìn)行熒光定量PCR[20]，對(duì)4種污水廠中廣泛報(bào)道的ARGs[9,21-22]進(jìn)行定量檢測，包括四環(huán)類抗性基因(tetA)、磺胺類抗性基因(sul1和sul2)和大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因(ermB)，同時(shí)監(jiān)測16SrDNA濃度以計(jì)算抗性基因的相對(duì)豐度，4種抗性基因及16SrDNA基因引物如表2所示[10]。定量PCR的步驟主要包括標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備、標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定和樣品中抗性基因絕對(duì)豐度的測定、數(shù)據(jù)分析。

首先，經(jīng)過PCR得到各個(gè)基因片段，經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳后用DNA純化試劑盒(Omega，美國)進(jìn)行純化。將純化的產(chǎn)物克隆至大腸桿菌，挑取陽性克隆，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，測定濃度并計(jì)算拷貝數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。將標(biāo)準(zhǔn)樣品連續(xù)10倍梯度稀釋后取5個(gè)梯度作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR。采用20 μL熒光定量PCR體系，其中正向、反向引物(10 μmol)各0.4 μL、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(天根生物科技有限公司，中國)10 μL、50×ROX Reference Dye (天根生物科技有限公司，中國)2 μL、ddH2O 6.2 μL、模板0.1 μL，反應(yīng)程序?yàn)?0個(gè)循環(huán)(95 ℃ 15 min→62 ℃ 30 s)，并生成溶解曲線，每個(gè)PCR進(jìn)行3次平行測定，PCR擴(kuò)增效率為88%～110%，確保標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(r2)>99%。用上述測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定樣品，并且每個(gè)平行樣品之間的偏差<5%。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)樣品擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)(CT)計(jì)算水樣中抗性基因的絕對(duì)豐度，并除以同一樣品的16SrDNA絕對(duì)豐度得到抗性基因的相對(duì)豐度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)顯著性在95%的置信水平(P<0.05)且在無假設(shè)條件下2個(gè)數(shù)據(jù)集顯著差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 eARGs的時(shí)間分布特征

SBR反應(yīng)器的污泥中a-eARGs和f-eARGs絕對(duì)豐度在啟動(dòng)和運(yùn)行期間的相對(duì)變化如圖1所示。由圖1(a)可知，在整個(gè)運(yùn)行17 d的周期，a-eARGs呈先增長后下降的趨勢。1～4 d，4種a-eARGs的豐度顯著增加0.1倍～10倍，第4天后開始降低，穩(wěn)定運(yùn)行階段其濃度低于啟動(dòng)期，為初始的31.2%～80.2%。與此類似，由圖1(b)可知，f-eARGs同樣呈先增長后降低的趨勢，在整個(gè)啟動(dòng)階段(1～7 d)f-eARGs的絕對(duì)濃度持續(xù)升高，最高提高倍數(shù)達(dá)110倍～3 116倍，而到運(yùn)行階段會(huì)出現(xiàn)下降但其絕對(duì)濃度仍高于初始值。

2.2 eARGs的空間分布特征

4種抗性基因在不同處理階段的總豐度如圖2(a)所示。從ARGs在所有形態(tài)中DNA的總豐度來看，好氧處理時(shí)ARGs的濃度最高，達(dá)1.0×1010～1.3×1010copies·L-1，厭氧階段ARGs的濃度有所下降，達(dá)4.4×109copies·L-1，到出水時(shí)ARGs的總濃度顯著下降，為8.0×108～9.8×108copies·L-1。

3類抗性基因的占比情況如圖2(b)所示。對(duì)比不同形態(tài)ARGs的變化趨勢發(fā)現(xiàn)(圖2(b))，在好氧階段iARGs占比在20.9%～40.6%，不足一半，說明此時(shí)活性污泥中ARGs主要以胞外形態(tài)存在。從2種eARGs的豐度來看，f-eARGs占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢，占比均在60%以上，tetA占比甚至達(dá)81.1%，相比之下a-eARGs占比較低，在0.3%～5.7%。這表明好氧處理可能導(dǎo)致f-eARGs顯著增加。在厭氧處理階段，iARGs是ARGs的主要存在形態(tài)，占比在41.1%～90.4%。相比之下，eARGs的豐度大幅降低，f-eARGs仍是eARGs的主要存在形式，但a-eARGs的比例相比好氧處理顯著升高，達(dá)到7.5%～31.9%。在最終出水中，iARGs的比例進(jìn)一步下降至9.8%～20.3%，而eARGs的占比相比好氧階段有所提高，達(dá)79.7%～90.2%，其中f-eARGs仍占據(jù)主導(dǎo)地位，比例達(dá)66.5%～86.9%，a-eARGs的比例為3.2%～13.3%。

圖1 4種抗性基因的結(jié)合型(a-eARGs) (a)和游離型(f-eARGs) (b)抗性基因的豐度隨運(yùn)行時(shí)間的變化Fig. 1 Changes in the abundance of four adsorbed extracellular antibiotic resistance genes (a-eARGs) (a) and free extracellular antibiotic resistance genes (f-eARGs) (b) with operation period

表1 反應(yīng)器進(jìn)水配方Table 1 The composition of the reactor’s influent

表2 抗性基因(ARGs)及16S rDNA基因引物Table 2 Primers of antibiotic resistance genes (ARGs) and 16S rDNA gene

2.3 曝氣強(qiáng)度對(duì)eARGs產(chǎn)生的影響

3種類型ARGs隨曝氣強(qiáng)度的變化如圖3所示。從總體趨勢看，曝氣強(qiáng)度的增加均促進(jìn)了a-eARGs和f-eARGs的豐度增加，如當(dāng)曝氣時(shí)間由3 h提高至5 h時(shí)，a-eARGs的豐度增加了2.1倍～6.2倍(圖3(b))，而f-eARGs的豐度增加了2.2倍～12.2倍(圖3(c))。進(jìn)一步對(duì)比iARGs(圖3(a))和eARGs隨曝氣強(qiáng)度的增加百分比，發(fā)現(xiàn)eARGs的增長倍數(shù)(a-eARGs增長倍數(shù)3.1倍～7.2倍；f-eARGs增長幅度4.0倍～13.2倍)顯著高于胞內(nèi)(1.6倍～2.7倍)(P<0.05)。另外，對(duì)比2種eARGs隨曝氣強(qiáng)度的增長趨勢，發(fā)現(xiàn)f-eARGs豐度增加更為顯著，說明曝氣增加使得ARGs更容易變成f-eARGs。相關(guān)性分析也支持這一結(jié)果，曝氣時(shí)間與f-eARGs的相關(guān)性系數(shù)(r2=0.83～0.97)大于與a-eARGs的相關(guān)性系數(shù)(r2=0.77～0.95)。

2.4 污泥負(fù)荷對(duì)eARGs產(chǎn)生的影響

3種類型ARGs隨污泥負(fù)荷的變化如圖4所示。從總體趨勢看，污泥負(fù)荷的增加也均促進(jìn)了2種胞外抗性基因豐度增加，如當(dāng)污泥負(fù)荷由0.1 kg(BOD)·(kg(MLSS)·d)-1增加到0.3 kg(BOD)·(kg(MLSS)·d)-1時(shí)，a-eARGs的豐度增加了1.9倍～13.3倍(圖4(b))，而f-eARGs的豐度增加了1.3倍～7.8倍(圖4(c))。進(jìn)一步對(duì)比胞內(nèi)和胞外隨污泥負(fù)荷的增加百分比，發(fā)現(xiàn)胞外的增長倍數(shù)(a-eARGs增長倍數(shù)3.0倍～14.2倍；f-eARGs增長幅度3.6倍～14.3倍)也高于胞內(nèi)(2.8倍～9.7倍)(P<0.05)。另外對(duì)比2種eARGs隨污泥負(fù)荷的增長趨勢，發(fā)現(xiàn)a-eARGs豐度增加更為顯著，說明污泥負(fù)荷的增加更有助于a-eARGs的產(chǎn)生。

3 討論(Discussion)

3.1 啟動(dòng)期eARGs大量產(chǎn)生而運(yùn)行期豐度顯著下降

在SBR活性污泥啟動(dòng)階段，2種eARGs均大量產(chǎn)生，可能是由于微生物處于馴化階段，部分微生物不適應(yīng)當(dāng)前環(huán)境而死亡裂解，使得iARGs轉(zhuǎn)化為eARGs。此外，一部分eARGs可能會(huì)與蛋白質(zhì)結(jié)合[17]，或者與顆粒等污泥成分相結(jié)合[23]而轉(zhuǎn)化為a-eARGs，導(dǎo)致其豐度增加。值得注意的是在啟動(dòng)階段f-eARGs的增長倍數(shù)和持續(xù)時(shí)間均顯著高于a-eARGs，這可能反映了二者在形成機(jī)制上的差異。首先一部分eARGs可能直接以自由態(tài)的形式存在，而另一部分ARGs雖然剛到達(dá)胞外時(shí)可能附著了蛋白質(zhì)或其他顆粒物，變成a-eARGs，但結(jié)合較松散[24]，隨著曝氣攪拌作用重新變?yōu)樽杂蓱B(tài)，導(dǎo)致f-eARGs增加的程度更高。

到了啟動(dòng)期末期和穩(wěn)定運(yùn)行階段，反應(yīng)器內(nèi)eARGs的濃度顯著下降?？赡苁怯捎谖⑸镆呀?jīng)完成馴化過程，由于不適應(yīng)環(huán)境而死亡的細(xì)菌數(shù)量大幅減少，微生物處于穩(wěn)定生長繁殖階段。同時(shí)啟動(dòng)期產(chǎn)生的大量eARGs通過每日配水被排出，導(dǎo)致eARGs濃度下降。此時(shí)樣品中的eARGs應(yīng)主要來源于微生物正常的死亡裂解或主動(dòng)分泌[14]。值得注意的是，盡管運(yùn)行期間兩者濃度都有明顯降低，但f-eARGs降低的程度和持續(xù)時(shí)間均低于a-eARGs，這表明eARGs在胞外傾向于以自由形態(tài)存在?？赡苁怯捎诒緦?shí)驗(yàn)采用配水，反應(yīng)器內(nèi)可與eARGs結(jié)合的顆粒物濃度相對(duì)較低。

3.2 好氧處理階段和出水中f-eARGs占主導(dǎo)

從ARGs總濃度的空間變化發(fā)現(xiàn)，好氧階段的ARGs濃度遠(yuǎn)高于厭氧階段和出水。該趨勢說明好氧處理是導(dǎo)致ARGs濃度升高的重要原因，由于活性污泥中的大部分微生物為好氧或兼性好氧微生物[25]，微生物在有氧的條件下新陳代謝加快，繁殖速率較高，因此產(chǎn)生更多的ARGs。相比之下，厭氧階段微生物新陳代謝減慢，眾多好氧性微生物不能增殖[26]，因此ARGs濃度下降。到了出水，ARGs濃度顯著低于活性污泥，說明排放的ARGs只占少部分，大部分ARGs仍存留在活性污泥中。

圖2 4種抗性基因在不同處理階段的總豐度(a)和3類抗性基因的比例(b)Fig. 2 Total abundance of four kinds of ARGs (a) and ratios of three forms of ARGs (b) in various treatment stages

圖3 胞內(nèi)抗性基因(iARGs) (a)、a-eARGs (b)和f-eARGs (c)隨曝氣強(qiáng)度的變化Fig. 3 Changes in intracellular ARGs (iARGs) (a), a-eARGs (b) and f-eARGs (c) with aeration intensity

圖4 iARGs (a)、a-eARGs (b)和f-eARGs (c)豐度隨污泥負(fù)荷的變化Fig. 4 Changes in iARGs (a), a-eARGs (b) and f-eARGs (c) with sludge loading rate

空間分布特征表明好氧階段以eARGs為主，且f-eARGs比例較高，而厭氧階段以iARGs為主，f-eARGs仍是主要的eARGs形態(tài)，但a-eARGs比例有所升高；出水中f-eARGs占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢。這主要是由于f-eARGs只存在于水中，而出水經(jīng)過與活性污泥沉淀分離，大部分胞內(nèi)ARGs被截留在污泥中，導(dǎo)致f-eARGs成為ARGs的主要存在形態(tài)。該結(jié)果表明處理后的污水雖然iARGs濃度顯著降低，但仍殘存極高濃度的eARGs，這在以往的研究中被極大忽略。eARGs可能通過轉(zhuǎn)化進(jìn)入受體細(xì)胞重新表達(dá)耐藥性，因而具有相當(dāng)高的環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)[27]。

3.3 曝氣強(qiáng)度和污泥負(fù)荷提高使2種eARGs豐度顯著提高

2種eARGs豐度隨曝氣強(qiáng)度提高而顯著提高，這和前面ARGs空間分布特征結(jié)果相符，說明好氧條件有利于eARGs的產(chǎn)生。eARGs的增長倍數(shù)顯著高于iARGs，這一現(xiàn)象說明eARGs產(chǎn)生不止來源于細(xì)胞衰老死亡，還有部分直接從細(xì)胞中主動(dòng)釋放，由于此時(shí)曝氣強(qiáng)度不會(huì)造成細(xì)胞直接死亡，因此推測細(xì)胞代謝活躍會(huì)導(dǎo)致ARGs主動(dòng)釋放，進(jìn)而eARGs豐度顯著增加[10,24]。f-eARGs提高程度高于a-eARGs可能是因?yàn)锳RGs變成eARGs之后，有一部分在較低曝氣強(qiáng)度時(shí)傾向于與介質(zhì)結(jié)合形成a-eARGs，但是曝氣強(qiáng)度增大后，eARGs與介質(zhì)的結(jié)合變得困難，導(dǎo)致f-eARGs增加多于a-eARGs。

另外一個(gè)有意思的現(xiàn)象是曝氣強(qiáng)度由4 h增至5 h eARGs的增加幅度顯著小于3 h增至4 h(P<0.05)。這可能是由于微生物可利用營養(yǎng)下降，微生物的生長速率難以進(jìn)一步提高[25]。此時(shí)，微生物主動(dòng)釋放ARG的趨勢可能在高曝氣強(qiáng)度時(shí)也有所下降，導(dǎo)致eARGs增長趨勢變慢。

2種eARGs豐度也會(huì)隨污泥負(fù)荷提高而提高，這一結(jié)果說明污泥負(fù)荷的增加也有利于eARGs的產(chǎn)生。顯然污泥負(fù)荷增加導(dǎo)致細(xì)菌繁殖速率加快，因此死亡釋放或主動(dòng)分泌產(chǎn)生的eARGs顯著增加。胞外的增長倍數(shù)也高于胞內(nèi)，再次證明eARGs產(chǎn)生來源于細(xì)胞衰老死亡和部分直接從未衰老的細(xì)胞中釋放。f-eARGs提高程度低于a-eARGs，這和曝氣強(qiáng)度的結(jié)果相反，可能是因?yàn)槲⑸镌诟郀I養(yǎng)的環(huán)境中產(chǎn)生胞外聚合物(extracellular polymer substance, EPS)增多[28]，使DNA本身以復(fù)合物的形式存在，或者更容易與EPS等物質(zhì)結(jié)合從而導(dǎo)致a-eARGs的增加。