李 霞,季萬里，高 月

山東醫(yī)學高等專科學校附屬醫(yī)院(臨沂市老年病醫(yī)院)：1.檢驗科；2.病理科，山東臨沂 276004；3.重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院檢驗科，重慶 400700

卵巢癌是一種嚴重威脅女性身心健康的常見婦科腫瘤，其發(fā)病隱匿、轉(zhuǎn)移率高，整體生存率較低，5年生存率不足30%[1]?；熓悄壳奥殉舶┑闹饕委熓侄危洳涣挤磻艽?。因此，卵巢癌的靶向治療及相關(guān)分子標志物的研究備受關(guān)注。文獻[2-3]報道wee1是一種屬于絲氨酸/蘇氨酸家族的蛋白激酶，在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進程中起到重要作用。目前，有關(guān)wee1基因在卵巢癌中的相關(guān)研究報道甚少。本研究觀察沉默wee1基因?qū)β殉舶┘毎鲋场⑶忠u、遷移的影響及其作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1材料 人卵巢癌SKOV3細胞購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD Biosciences公司；Transwell小室購自美國Millipore公司；小干擾RNA(siRNA)由上海吉瑪公司合成；鼠抗人Wnt3a單克隆抗體、鼠抗人β-連環(huán)蛋白(β-catenin)單克隆抗體、鼠抗人細胞周期蛋白D1(Cyclin-D1)單克隆抗體、鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶7(MMP-7)單克隆抗體和鼠抗人β-actin多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。Lipofectamine 2000購自上海吉瑪公司，CFX96實時熒光定量PCR(qPCR)儀購自美國伯樂公司。

1.2方法

1.2.1卵巢癌細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將卵巢癌細胞培養(yǎng)在含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中，放置在37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中。待細胞融匯至80%，按每孔1×105個細胞加入6孔板，待細胞密度達到50%，按Lipofectamine 2000說明書轉(zhuǎn)染細胞。試驗共分3組：Blank組、siRNA陰性對照(siRNA-NC)組和攜帶wee1基因片段(siRNA-wee1)組。將siRNA-NC組(GCTGTTTTTTGAGATTTCAG)和siRNA-wee1組(ACGCTCTGTCAGCCTTACTA-TA)轉(zhuǎn)染SKOV3細胞，Blank組不轉(zhuǎn)染。

1.2.2qPCR 收集上述3組卵巢癌細胞，按照操作說明提取總RNA并測定RNA表達水平。以1 μg RNA為模板，按qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA;以1 μL cDNA為模板，采用qPCR檢測wee1 RNA表達水平。反應條件：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，40個循環(huán)。引物序列Sence:5′-CCACCACCCT-GCCAGTTAA-3′，Antisence:5′-TAAACTTTTGT-GCAA CCAGGGTAA-3′。wee1 RNA表達水平采用2-ΔΔCt法確定。

1.2.3卵巢癌細胞平板集落形成試驗 將轉(zhuǎn)染后的3組卵巢癌細胞懸液(1×106/L)加入12孔板，輕輕混勻，隔2天換1次培養(yǎng)液。孵育10 d后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，然后用4%多聚甲醛固定10 min，PBS再清洗3次，最后用0.2%結(jié)晶紫染色10 min，肉眼計數(shù)集落數(shù)，試驗重復3次。

1.2.4劃痕試驗 用直尺在6孔板背后劃橫線。在孔中分別加入5×105個轉(zhuǎn)染后的3組卵巢癌細胞。第2天用槍頭垂直于背后的橫線劃痕，PBS清洗3次，加入無血清培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于0、12、24 h取樣拍照。

1.2.5Transwell試驗 試驗前1 d將無FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液和Matrigel基質(zhì)膠按8∶1混合，將60 μL混合液加入到Transwell小室，培養(yǎng)過夜。試驗前，將無FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基100 μL加入小室中，繼續(xù)培養(yǎng)30 min。將上述轉(zhuǎn)染24 h的卵巢癌細胞消化并計數(shù)，將200 μL細胞懸液加入Millicell小室中，下室加入600 μL條件培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)15 h，然后用4%多聚甲醛固定細胞，染色后倒置顯微鏡拍照。

1.2.6免疫印跡法(WB)檢測 在各組轉(zhuǎn)染48 h的卵巢癌細胞中加入裂解液，裂解細胞后提取總蛋白并測其水平。取30 μL蛋白樣品進行上樣，8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，分別加入wee1、Wnt3a、β-catenin、Cyclin-D1、MMP-7單克隆抗體孵育過夜再加入二抗封閉1 h。ECL化學發(fā)光曝光，Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照，測定Wnt3a、β-catenin、Cyclin-D1、MMP-7蛋白表達水平。上述蛋白測定均以β-actin為內(nèi)參，蛋白表達水平=目的蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染后3組卵巢癌細胞wee1 mRNA及蛋白表達水平比較 利用qPCR和WB檢測轉(zhuǎn)染后卵巢癌細胞wee1 mRNA及蛋白表達情況，結(jié)果顯示，3組卵巢癌細胞的wee1 mRNA表達水平比較，Blank組(3.51±0.96)與siRNA-NC組(3.69±0.88)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，siRNA-wee1組(0.92±0.19)低于Blank組和siRNA-NC組(P<0.05)，見圖1A。WB結(jié)果顯示siRNA-wee1組wee1蛋白表達水平低于siRNA-NC組和Blank組(P<0.05)，見圖1B。

注：A為3組wee1 mRNA表達情況；B為wee1蛋白表達情況；與Blank組比較，aP<0.05；與siRNA-NC組比較，bP<0.05。圖1 轉(zhuǎn)染后3組卵巢癌細胞wee1 mRNA及蛋白表達水平

2.2沉默wee1基因后3組卵巢癌細胞平板集落形成情況比較 沉默wee1基因后卵巢癌細胞平板集落形成試驗結(jié)果顯示，siRNA-wee1組卵巢癌細胞集落形成數(shù)少于Blank組和siRNA-NC組(P<0.05)，見圖2。

注：A為3組卵巢癌細胞集落形成圖；B為3組卵巢癌細胞集落形成數(shù)比較。與Blank組比較，aP<0.05；與siRNA-NC組比較，bP<0.05。圖2 沉默wee1基因后3組卵巢癌細胞集落形成情況

2.3沉默wee1基因后3組卵巢癌細胞遷移能力比較 利用細胞劃痕愈合試驗觀察沉默wee1基因后卵巢癌細胞遷移能力，結(jié)果顯示siRNA-wee1組卵巢癌細胞12 h、24 h的遷移距離小于siRNA-NC組和Blank組(P<0.05)。

2.4沉默wee1基因后3組卵巢癌細胞侵襲能力比較 利用Transwell試驗觀察沉默wee1基因后卵巢癌細胞侵襲能力，結(jié)果表明siRNA-wee1組卵巢癌細胞穿膜數(shù)量少于siRNA-NC組和Blank組(P<0.05)，見圖3。

注：A為3組卵巢癌細胞侵襲能力圖；B為3組卵巢癌細胞穿膜數(shù)比較。與Blank組比較，aP<0.05；與siRNA-NC組比較，bP<0.05。圖3 沉默wee1基因后卵巢癌細胞侵襲能力

2.5沉默wee1基因后3組卵巢癌細胞Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較 利用WB檢測沉默wee1基因后Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達情況，結(jié)果顯示，siRNA-wee1組Wnt3a、β-catenin、Cyclin-D1和MMP-7蛋白表達水平均低于siRNA-NC組和Blank組(P<0.05)，見圖4。

注：A為3組WB檢測Wnt3a/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達情況；B為3組Wnt3a/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較。與Blank組比較，aP<0.05；與siRNA-NC組比較，bP<0.05。圖4 沉默wee1基因后Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達情況

3 討 論

wee1蛋白激酶是人wee激酶家族的成員之一，最早在裂殖酵母細胞中被發(fā)現(xiàn)，其結(jié)構(gòu)由位于中間的激酶結(jié)構(gòu)域、氨基端的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域和一個短的羧基端組成，編碼含有647個氨基酸的蛋白質(zhì)，主要分布在細胞核中[4-5]。wee1蛋白激酶是G2/M期檢查點的關(guān)鍵蛋白激酶，能夠特異性地參與細胞周期的調(diào)節(jié)，其表達異常影響細胞周期的正常運行，進而改變細胞的生物學功能[6]。研究發(fā)現(xiàn)，敲除老鼠體內(nèi)wee1基因，其胚胎因wee1基因缺失，DNA受損無法修復，誘發(fā)細胞進行有絲分裂而死亡[7]。wee1基因不僅在機體胚胎發(fā)育等方面起重要作用，而且在維持腫瘤細胞生物學行為方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[8-9]。文獻[10-13]報道wee1蛋白激酶在卵巢癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等多種腫瘤中高表達，而且其高表達與患者預后生存相關(guān)。卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率呈明顯上升趨勢，而且病死率居婦科腫瘤之首。本研究在卵巢癌細胞中沉默Wee1基因后發(fā)現(xiàn)卵巢癌細胞的增殖、侵襲、遷移能力均受到抑制，說明沉默wee1基因能夠抑制卵巢癌細胞的惡性增殖進程，進而阻礙卵巢癌的轉(zhuǎn)移。

卵巢癌在女性腫瘤中發(fā)病率和病死率均較高，而且惡性程度較高，因此深入研究其發(fā)病機制具有重要的臨床意義。文獻[14-15]報道，Wnt/β-catenin信號通路作為細胞內(nèi)Wnt信號傳導的重要經(jīng)典途徑參與惡性腫瘤的增殖、分化、侵襲、遷移等。一旦Wnt信號被激活，引起β-catenin聚集在細胞質(zhì)和細胞核中，激活下游靶基因的活性，引起細胞異常增殖和遷移[16-17]。有報道顯示，沉默wee1能夠抑制直腸癌細胞的生長、侵襲、遷移，并顯著抑制Wnt/β-catenin通路中的Wnt3a和β-catenin基因表達水平，表明RNA干擾wee1基因抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移很可能是通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控來完成的[12]。Cyclin-D1和MMP-7作為β-catenin的下游靶基因，直接受β-catenin的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，過表達Cyclin-D1可促進腫瘤的侵襲、遷移，MMP-7過表達可促進腫瘤的生長和細胞侵襲能力[18-19]。本研究結(jié)果顯示，沉默wee1基因后Wnt3a、β-catenin、Cyclin-D1和MMP-7蛋白表達均下調(diào)，表明沉默wee1基因能夠抑制Wnt/β-catenin 信號通路的激活，下調(diào)其下游靶基因Cyclin-D1和MMP-7表達水平來抑制卵巢癌細胞增殖、侵襲和遷移。

綜上所述，沉默wee1基因可抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，進而抑制卵巢癌細胞的增殖、侵襲和遷移過程，從而抑制卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展。該分子機制的闡述為進一步尋找卵巢癌的治療靶點提供了研究方向。