丁春曉，王 健，劉小虎，杜明偉，李建華，方長清

全球肺癌的發(fā)病率和病死率增長較快，對人類的生命健康造成巨大威脅。近年，我國肺癌的發(fā)病率增長最快，位居男性惡性腫瘤的第1位，位居女性惡性腫瘤的第2位，而在美國等其他國家，肺癌甚至是因癌癥致死的首要因素[1-4]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占肺腫瘤的85%，約56%患者在確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移[5-6]。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中，新生血管的生成至關(guān)重要[7]，其作用是為腫瘤組織提供營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣。然而，在實(shí)際治療過程中，抗腫瘤血管生成的臨床療效遠(yuǎn)達(dá)不上預(yù)期。這提示腫瘤血管生成可能不是腫瘤唯一的微循環(huán)機(jī)制，或許還存在血管擬態(tài)(vascufogenicmimicry, VM)現(xiàn)象。Maniotis等[8]于1999年首次在部分高度侵襲性葡萄膜黑色素瘤組織中證實(shí)VM現(xiàn)象的存在。目前關(guān)于NSCLC的轉(zhuǎn)移性惡性胸腔積液(malignant pleural effusion, MPE)腫瘤細(xì)胞中存在血管新生和VM現(xiàn)象的文獻(xiàn)，鮮有報(bào)道。因此，本文著重從細(xì)胞學(xué)角度出發(fā)，在NSCLC轉(zhuǎn)移性MPE脫落細(xì)胞中，探討VM現(xiàn)象。

1 材料與方法

1.1 材料收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2018年1月～2020年12月接收的胸水標(biāo)本1 425例，對液基細(xì)胞薄層檢測(thinprep cytology test, TCT)診斷陽性及可疑陽性標(biāo)本進(jìn)行離心沉渣包埋，行HE及免疫組化染色以篩選NSCLC，并通過回顧性查找病史，匯總臨床資料。

1.2 主要試劑TTF-1、SPA、SPB、CK7、CK5/6、CD105、CD34、CD31、FⅧRAg、D2-40、LYVE-1、CD31、VEGF、FGF和GAPDH等抗體以及免疫組化、免疫熒光檢測所需試劑盒均購自福州邁新公司。

1.3 TCT檢測收集新鮮胸水20 mL左右，室溫下800 r/min離心5 min，棄上清，取沉淀于底部的細(xì)胞，加入清洗液后再次離心，取沉淀與保存液混合后機(jī)器自動制片，中性樹膠封固。

1.4 胸水沉渣包埋[9]胸水標(biāo)本室溫下自然沉淀4 h，棄上清，取剩余自然沉淀液20 mL倒入離心管，室溫下2 000 r/min離心10 min，再次棄上清，用剪刀剪斷離心管最底部，其內(nèi)即為沉淀物，一起放入包埋盒，經(jīng)10%中性福爾馬林固定、脫水、包埋。

結(jié)果判讀：NSCLC患者胸腔積液中的脫落腫瘤細(xì)胞經(jīng)沉渣包埋制片后，鏡下觀察細(xì)胞可呈管腔樣排列，且形式多樣，其中可見單個腫瘤細(xì)胞形成的脈管樣管型結(jié)構(gòu)，也可見多個腫瘤細(xì)胞圍成的脈管樣管型結(jié)構(gòu)，有些管腔樣結(jié)構(gòu)可呈共壁聯(lián)環(huán)型，有時(shí)可見多個腫瘤細(xì)胞共壁于基膜。通讀HE染色，鏡下觀察VM現(xiàn)象，每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野(200×)，計(jì)數(shù)具有以上任一形式的VM現(xiàn)象中具有完整管腔的數(shù)量，結(jié)果用中位數(shù)四分位間距表示。

1.5 免疫熒光切片脫蠟、抗原修復(fù)、血清封閉、滴加一抗孵育過液，PBS沖洗，滴加熒光素標(biāo)記的二抗、避光室溫孵育，PBS沖洗、封固，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

結(jié)果判讀：對CD31、D2-40，CD105、LYVE-1，CD34、LYVE-1，F(xiàn)ⅧRAg、D2-40進(jìn)行熒光雙染，陽性為胞質(zhì)陽性。

1.6 免疫組化采用免疫組化SP法染色，PBS稀釋一抗，生物素標(biāo)記二抗，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固。

結(jié)果判讀：由兩名病理診斷醫(yī)師獨(dú)立檢查5個代表性高倍視野(200×)，識別陽性染色的腫瘤細(xì)胞，合計(jì)檢測100個連續(xù)細(xì)胞，通過陽性染色細(xì)胞數(shù)/檢測腫瘤細(xì)胞的總數(shù)計(jì)算陽性百分比：陽性細(xì)胞數(shù)<5%為陰性，≥5%為陽性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)，結(jié)果用中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC患者的篩選在1 425例胸水標(biāo)本中，對既往TCT診斷結(jié)果為惡性細(xì)胞、可疑惡性細(xì)胞或見核異質(zhì)細(xì)胞等結(jié)果的標(biāo)本，進(jìn)行進(jìn)一步沉渣包埋，HE染色結(jié)合免疫組化最終確定323例為NSCLC胸水標(biāo)本。其中女性189例，中位年齡67歲；男性134例，中位年齡70歲。同時(shí)，通過HE和免疫組化染色對NSCLC進(jìn)行組織學(xué)分型：其中肺腺癌(TTF-1、Napsin-A、CK7等陽性)174例，肺鱗狀細(xì)胞癌(CK5/6、p40、p63、CK34βE12等陽性)108例，腺鱗癌24例，大細(xì)胞癌17例。

2.2 HE染色觀察VM現(xiàn)象沉渣包埋HE染色切片顯示腫瘤細(xì)胞呈脈管樣管型結(jié)構(gòu)排列(圖1)，VM形成數(shù)量：腺癌為10(10，20)個、鱗狀細(xì)胞癌為12.5(10，20)個、腺鱗癌為12.5(5，17.5)個、大細(xì)胞癌為10(5，20)個，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.102，P>0.05)。

圖1 沉渣包埋切片腫瘤細(xì)胞呈脈管樣管型結(jié)構(gòu)排列

2.3 VM現(xiàn)象中脈管樣管型結(jié)構(gòu)NSCLC標(biāo)志物的表達(dá)為進(jìn)一步判斷脈管樣管型結(jié)構(gòu)是否由NSCLC成分細(xì)胞分化形成，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了NSCLC細(xì)胞特異性標(biāo)志物免疫細(xì)胞化學(xué)染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)特異性標(biāo)志物陽性率分別是：TTF-1為92.88%(300/323)(圖2A)、CK7為93.81%(303/323)(圖2B)、CK5/6為8.98%(29/323)、CD133為89.78%(290/323)、SPA為68.11%(220/323)、SPB為55.73%(180/323)。

2.4 VM現(xiàn)象中脈管樣管型結(jié)構(gòu)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)鑒于在VM現(xiàn)象中有脈管樣管型形成，為鑒定新分化形成的類脈管結(jié)構(gòu)是否具有真正的脈管系統(tǒng)功能，本實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行了血管內(nèi)皮及淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫標(biāo)志物染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各標(biāo)志物均呈不同程度的表達(dá)。其中血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的陽性率分別是：CD105為65.33%(211/323)、CD34為69.04%(223/323)(圖2C)、CD31為75.54%(244/323)、FⅧRAg 為55.42%(179/323)，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物陽性率分別為：D2-40為76.78%(248/323)(圖2D)、LYVE-1為72.76%(235/323)，同時(shí)，F(xiàn)GF和VEGF的陽性率分別為75.54%(244/323)和77.71%(251/323)。

ABCD

2.5 免疫熒光染色結(jié)果MPE中NSCLC脫落細(xì)胞分化形成的脈管樣管型結(jié)構(gòu)經(jīng)免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，脈管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD105、D2-40、LYVE-1、CD31、CD34、FⅧRAg均陽性(圖3)。

AB

3 討論

近年來NSCLC的發(fā)病率逐年增加，且越發(fā)年輕化，尤其在新冠疫情常態(tài)化管理的當(dāng)下，肺CT檢查率增加，這使得一些早期癥狀不明顯的肺患者被發(fā)現(xiàn)。然而，絕大部分患者發(fā)現(xiàn)即為晚期，已發(fā)生轉(zhuǎn)移。惡性腫瘤區(qū)別于良性腫瘤，就是因?yàn)槠渚哂星忠u和轉(zhuǎn)移的能力，對機(jī)體危害大，甚至常因其而致命。腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程是呈動態(tài)變化且極其復(fù)雜的，主要包括基因水平的失衡、營養(yǎng)新生血管的生成、細(xì)胞間基質(zhì)的變化及微環(huán)境的變化等[10]。其中血管生成是一關(guān)鍵環(huán)節(jié)。20世紀(jì)70年代初，F(xiàn)olkman[11]提出“腫瘤細(xì)胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移均依賴于腫瘤組織內(nèi)新生血管生成”的理論，成為腫瘤研究領(lǐng)域的重要里程碑。然而，臨床治療過程中抗腫瘤血管生成的臨床療效并不理想，學(xué)者們便設(shè)想VM現(xiàn)象的存在。VM現(xiàn)象是一種由非內(nèi)皮細(xì)胞組成的微血管通道，其是由惡性腫瘤細(xì)胞和一種PAS染色陽性的細(xì)胞外基質(zhì)組成的，其形成主要包括惡性腫瘤細(xì)胞的自身變形、細(xì)胞外基質(zhì)的重塑以及由此產(chǎn)生的與現(xiàn)有血管相連的脈管樣結(jié)構(gòu)，進(jìn)而為腫瘤生長提供了充足的血液供應(yīng)[12-15]。在VM現(xiàn)象中，由非內(nèi)皮細(xì)胞排列的脈管樣管腔結(jié)構(gòu)是由多能干細(xì)胞、高侵襲性的腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，其模擬了血管的功能，使紅細(xì)胞可以通過血管流動，并具有替代功能，當(dāng)依賴于內(nèi)皮細(xì)胞的血管生長跟不上腫瘤組織的生長時(shí)，一些腫瘤細(xì)胞就會改變原有的功能，模仿內(nèi)皮細(xì)胞的功能，這些機(jī)制都表明VM現(xiàn)象在惡性腫瘤的血液供應(yīng)中起著重要作用[12,16-17]。在近年來，通過激光掃描共聚焦血管造影、電子顯微鏡、三維細(xì)胞培養(yǎng)等先進(jìn)技術(shù)，先后在乳腺癌、肝癌、膠質(zhì)瘤、卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌等惡性腫瘤中證實(shí)了VM的存在。

鑒于此，我們設(shè)想，腫瘤組織學(xué)中常見的血管新生和VM現(xiàn)象在NSCLC患者M(jìn)PE腫瘤細(xì)胞中是否也存在呢？NSCLC患者M(jìn)PE中脫落的腫瘤細(xì)胞具備惡性程度高、分化程度低和可塑性強(qiáng)的特點(diǎn)，在失去血液供應(yīng)低氧條件下，在胸水中為了適應(yīng)這種缺氧微環(huán)境是否會進(jìn)行自我調(diào)整，進(jìn)而分化形成新生血管和具有VM的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能。本實(shí)驗(yàn)對 1 425 例胸水標(biāo)本采用TCT技術(shù)進(jìn)行制片診斷，最終確認(rèn)323例NSCLC，發(fā)現(xiàn)在TCT細(xì)胞學(xué)制片下腫瘤細(xì)胞或呈緊密排列的彩球狀，或呈鱗片狀，或是燈泡狀排列的結(jié)構(gòu)。沉渣包埋HE染色中發(fā)現(xiàn)上述形態(tài)結(jié)構(gòu)的腫瘤細(xì)胞分化形成不同形態(tài)的脈管樣管型結(jié)構(gòu)。通過免疫組化證實(shí)，排列成脈管樣結(jié)構(gòu)的腫瘤細(xì)胞表達(dá)TTF-1、SPA、SPB、CK7、CK5/6等腫瘤標(biāo)志物，驗(yàn)證了構(gòu)成脈管樣結(jié)構(gòu)的這些細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)又對其進(jìn)行脈管上皮相關(guān)抗體標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)CD105、CD34、CD31、FⅧRAg、D2-40、LYVE-1等標(biāo)志物均陽性。對于腫瘤細(xì)胞中與血管內(nèi)皮相關(guān)抗體的表達(dá)，有學(xué)者認(rèn)為，可以通過腫瘤干細(xì)胞的可塑性來解釋。有研究在神經(jīng)母細(xì)胞腫瘤中發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞具有向內(nèi)細(xì)胞分化的能力[18-21]。本研究結(jié)合上述結(jié)果得出，NSCLC胸腔積液中的脫落腫瘤細(xì)胞能夠形成脈管樣管型結(jié)構(gòu)，其中一部分的形成機(jī)制為VM或血管新生，另一部分來自于腫瘤細(xì)胞分化形成的脈管樣結(jié)構(gòu)，具有內(nèi)皮細(xì)胞功能，但機(jī)制不清。因此，作者大膽提出了腫瘤細(xì)胞-脈管樣管型假說，即在細(xì)胞學(xué)中，NSCLC患者胸腔積液中的脫落腫瘤細(xì)胞(上皮細(xì)胞)為了克服低氧微環(huán)境可以向血管內(nèi)皮和(或)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分化并形成脈管樣管型結(jié)構(gòu)。腫瘤細(xì)胞這種脈管樣管型的形成有利于腫瘤細(xì)胞間的物質(zhì)交換和代謝，充當(dāng)了“制氧機(jī)”的作用，加快了腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步侵襲和轉(zhuǎn)移。CD133為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，在本研究中其染色為陽性，作者推測腫瘤細(xì)胞具有干細(xì)胞的功能，在外界環(huán)境需要的情況下分化為不同功能的細(xì)胞，對自身生存提供有利的環(huán)境。腫瘤細(xì)胞脈管樣結(jié)構(gòu)在分化過程中可能與新生的正常血管內(nèi)皮細(xì)胞或淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞連接，最終嫁接到正常的某一段血管或淋巴管，進(jìn)入血液淋巴循環(huán)通道，形成新的轉(zhuǎn)移灶。

NSCLC常規(guī)治療往往對進(jìn)展NSCLC的療效有限，總的5年生存率僅為15%[22]。因此，抑制腫瘤血管生成就成為腫瘤治療的核心策略之一，研究NSCLC的血管新生和血管生成機(jī)制將為探索腫瘤血管生成抑制劑治療肺癌提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)為深入理解腫瘤血管形成的原理和分子機(jī)制以及探索臨床上抗腫瘤血管生成藥物治療的新靶標(biāo)提供了前期基礎(chǔ)。