劉 穎，徐 然，王姝昊，白麗娜，林貞花，樸紅心

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的發(fā)病率和病死率均較高，占全世界癌癥發(fā)生率的7%[1]。由于HCC發(fā)病的高隱匿性、高轉(zhuǎn)移性，且缺乏有效的早期診斷標(biāo)志物，HCC患者的5年生存率僅17%～20%[2-3]。因此，探尋新的潛在新型生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)于HCC患者的早期診斷及分子靶向治療具有重要意義。

凝縮蛋白復(fù)合物在真核生物染色體凝縮過程中發(fā)揮重要作用，在脊椎動(dòng)物中有兩種凝縮蛋白復(fù)合物，分別為凝縮蛋白復(fù)合物Ⅰ及凝縮蛋白復(fù)合物Ⅱ[4]。凝縮蛋白復(fù)合物Ⅰ主要定位在細(xì)胞質(zhì)，染色體凝縮蛋白復(fù)合物Ⅰ的亞基D2(non-SMC condensinⅠcomplex subunit D2, NCAPD2)屬于其亞基之一，位于染色體12p13.31[5-6]，介導(dǎo)復(fù)合體在染色質(zhì)上的募集和定位，主要參與細(xì)胞周期過程中染色體的凝集和分離[7]。有報(bào)道稱，在果蠅中人為干擾NCAPD2的表達(dá)會(huì)影響其它凝縮蛋白亞基在染色體上的正常定位，從而影響細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程[8-9]。近年研究顯示，NCAPD2在多種惡性腫瘤中異常高表達(dá)且發(fā)揮重要作用，NCAPD2異常表達(dá)與前列腺癌細(xì)胞遷移、侵襲及周期轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制密切相關(guān)。此外相關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)NCAPD2蛋白高表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床分期和分化程度呈正相關(guān)，提示患者的不良預(yù)后。然而，NCAPD2與HCC演進(jìn)之間的關(guān)系尚未見報(bào)道。本文旨在應(yīng)用數(shù)據(jù)庫(kù)及免疫組化法檢測(cè)NCAPD2在正常肝組織和HCC組織中的差異表達(dá)，并探討其表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系，為尋找新的HCC診治及預(yù)后的分子標(biāo)志物提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床資料 70例HCC組織和20例正常肝組織標(biāo)本芯片，購(gòu)自上海芯超生物公司。70例HCC中，男性66例，女性4例；年齡<60歲者62例，≥60歲者8例；腫瘤直徑<3.0 cm者44例，≥3.0 cm者26例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者2例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者68例；分化程度：高分化4例，中分化41例，低分化25例；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期10例，Ⅲ+Ⅳ期60例。

1.1.2主要試劑 NCAPD2抗體購(gòu)自中國(guó)Abcam公司，免疫組化SP兩步法試劑盒、檸檬酸緩沖液、PBS緩沖液、DAB顯色劑和蘇木精染料，均購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化SP兩步法檢測(cè)NCAPD2蛋白表達(dá)。4 μm厚切片，60 ℃烤片40～60 min，二甲苯進(jìn)行常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化，微波爐加熱檸檬酸鹽緩沖液4～8 min進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加一抗NCAPD2(1 ∶75)，4 ℃孵育過夜。次日滴加二抗，DAB顯色，蘇木精對(duì)比染色，中性樹膠封固。為證明NCAPD2抗體免疫組化檢測(cè)的特異性，選用NCAPD2陽性染色切片作為陽性對(duì)照，以PBS代替一抗的染色結(jié)果作為陰性對(duì)照。

1.2.2結(jié)果判斷 NCAPD2陽性染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)以著色強(qiáng)度及著色細(xì)胞數(shù)綜合判斷。(1)按陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)按細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)分：陽性細(xì)胞數(shù)0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項(xiàng)得分相乘作為最終評(píng)分：0～1分為陰性(-)，2～4分為弱陽性(+)，5～7分為中度陽性()，≥8分為強(qiáng)陽性()。

1.3 生信分析應(yīng)用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)(https://ualcan.path.uab.edu/index.html)分析HCC組織和正常組織中NCAPD2 mRNA的表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性。應(yīng)用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn)和Oncolnc數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.oncolnc.org)分析NCAPD2蛋白與HCC患者生存期的相關(guān)性。應(yīng)用GO富集功能分析NCAPD2參與的生物學(xué)進(jìn)程。STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string.db.org)分析NCAPD2蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件和GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；NCAPD2蛋白表達(dá)與HCC臨床病理特征的相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)法；運(yùn)用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生存分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC組織中NCAPD2 mRNA的表達(dá)通過UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析371例HCC組織和50例正常組織中NCAPD2 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示：與正常組織相比，HCC組織中NCAPD2 mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01，圖1A)。進(jìn)一步分析NCAPD2 mRNA表達(dá)與HCC臨床病理特征的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，其與HCC組織學(xué)分級(jí)、臨床分期和TP53突變密切相關(guān)(P<0.01)。NCAPD2 mRNA隨著HCC組織學(xué)分級(jí)降低，其表達(dá)水平逐漸上調(diào)(P<0.01，圖1B)；與正常組織相比，NCAPD2 mRNA在不同分期HCC組織中的表達(dá)水平均明顯增強(qiáng)，且隨臨床分期呈升高趨勢(shì)(P<0.01，圖1C)，但臨床分期Ⅳ除外。與正常組織和TP53未突變HCC組織相比，NCAPD2 mRNA表達(dá)水平在TP53突變HCC組織中異常高表達(dá)(P<0.01，圖1D)，提示NCAPD2表達(dá)與HCC的惡性程度和TP53基因突變呈正相關(guān)。

圖1 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析NCAPD2 mRNA在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平：A.NCAPD2 mRNA在正常肝組織和肝癌組織中的表達(dá)；B.NCAPD2 mRNA表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系；C.NCAPD2 mRNA表達(dá)與臨床分期的關(guān)系；D.NCAPD2 mRNA表達(dá)與TP53基因突變的關(guān)系

2.2 HCC組織中NCAPD2蛋白的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，NCAPD2蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，少量表達(dá)于細(xì)胞核，其在正常組織中呈陰性或低表達(dá)，在HCC組織中呈陽性或強(qiáng)陽性(圖2)。在70例HCC組織中，NCAPD2蛋白的陽性率(77.1%，54/70)和強(qiáng)陽性率(51.4%，36/70)均顯著高于癌旁正常組織(45.0%和25.0%，P<0.01，表1)。

表1 正常組織和肝細(xì)胞癌組織中NCAPD2蛋白的表達(dá)

ABCD

2.3 NCAPD2蛋白與HCC臨床病理特征的相關(guān)性通過分析NCAPD2表達(dá)與HCC臨床病理特征的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，NCAPD2表達(dá)與HCC組織學(xué)分級(jí)和臨床分期顯著相關(guān)(P<0.05)，而與HCC患者性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無明顯相關(guān)性(P>0.05，表2)，與UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果相一致。其中，NCAPD2在低分化組織中的強(qiáng)陽性率(84.0%，21/25)明顯高于中分化(78.0%，32/41)和高分化組織(25.0%，1/4)(P<0.05)；NCAPD2蛋白在臨床分期Ⅲ+Ⅳ期HCC組織中的強(qiáng)陽性率(75.0%，45/60)明顯高于Ⅰ+Ⅱ期HCC組織(40.0%，4/10)(P<0.05)。上述結(jié)果提示：NCAPD2蛋白可能參與HCC的惡性演進(jìn)。

表2 NCAPD2蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 NCAPD2表達(dá)與HCC患者預(yù)后的關(guān)系應(yīng)用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析NCAPD2表達(dá)與HCC患者預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，NCAPD2高表達(dá)患者的總生存期和無瘤生存期明顯短于低表達(dá)患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3A、B)；Oncolnc數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果與之相符，NCAPD2高表達(dá)預(yù)示HCC患者較差的生存期(P<0.05，圖3C、D)。上述結(jié)果提示：NCAPD2高表達(dá)與患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)。

圖3 NCAPD2表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者生存期的相關(guān)性：A.GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示NCAPD2蛋白高表達(dá)者的總生存率均低于NCAPD2蛋白低表達(dá)者；B.GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示NCAPD2蛋白高表達(dá)者的無瘤生存率低于NCAPD2蛋白低表達(dá)者；C、D.Oncolnc生存曲線分析顯示NCAPD2蛋白高表達(dá)者的總生存率(C)和疾病特異生存率(D)均低于NCAPD2蛋白低表達(dá)者

2.5 NCAPD2參與的生物學(xué)功能及蛋白互作進(jìn)程GO富集分析顯示，NCAPD2主要參與細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)定位和細(xì)胞增殖等生物學(xué)功能(圖4A)。進(jìn)一步通過STRING數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)，NCAPD2的互作蛋白主要為細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白SMC2、SMC4、CDK1和CDC5L等(圖4B)。提示NCAPD2可能通過調(diào)控細(xì)胞增殖影響腫瘤的惡性演進(jìn)。

圖4 A.GO富集分析顯示NCAPD2蛋白參與的細(xì)胞生物學(xué)功能；B.STRING數(shù)據(jù)庫(kù)顯示NCAPD2蛋白與相關(guān)蛋白的互作進(jìn)程

3 討論

NCAPD2在淋巴結(jié)、骨髓、脂肪等組織中普遍表達(dá)，組成凝縮蛋白復(fù)合物的亞基在細(xì)胞中表達(dá)異常均與癌癥的發(fā)生有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，NCAPD2在非小細(xì)胞肺癌組織中異常高表達(dá)，且與肺癌患者臨床預(yù)后不良呈正相關(guān)。冷紅等[10]的研究揭示，NCAPD2可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，與乳腺腫瘤分級(jí)及乳腺癌內(nèi)分泌治療等密切相關(guān)。王玉等[11]的研究結(jié)果亦證實(shí)，NCAPD2高表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌的增殖、侵襲和遷移，與胃癌的發(fā)展呈正相關(guān)。以上研究結(jié)果均提示，NCAPD2與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其有望成為治療癌癥的新靶標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)評(píng)估了NCAPD2表達(dá)與HCC之間的相關(guān)性。UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)，NCAPD2 mRNA表達(dá)在HCC中顯著增強(qiáng)，其高表達(dá)與HCC臨床分期、組織學(xué)分級(jí)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，提示NCAPD2在HCC的惡性演進(jìn)中扮演著重要角色。數(shù)據(jù)庫(kù)分析亦發(fā)現(xiàn)，NCAPD2表達(dá)與TP53基因突變存在明顯相關(guān)性(P<0.05)，且TP53突變的腫瘤表現(xiàn)為細(xì)胞周期相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)增強(qiáng)[12]，提示NCAPD2可能與HCC的細(xì)胞周期進(jìn)程存在互作關(guān)系。進(jìn)一步免疫組化染色結(jié)果與UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果一致，NCAPD2蛋白在HCC組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，并與HCC組織學(xué)分級(jí)和臨床分期密切相關(guān)(P<0.05)。國(guó)內(nèi)匡滿超[13]的研究結(jié)果與之相符合，其研究顯示NCAPD2在乳腺癌組織中高表達(dá)，且與乳腺癌組織學(xué)分級(jí)、臨床分期等病理參數(shù)關(guān)系密切。提示NCAPD2可能在HCC的惡性演進(jìn)中發(fā)揮重要的促癌作用。此外，探究NCAPD2蛋白表達(dá)與HCC患者預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，NCAPD2高表達(dá)HCC患者的總生存期及無瘤生存期更短。這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致，NCAPD2高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后不良密切相關(guān)。提示NCAPD2蛋白高表達(dá)可能是判斷HCC不良預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。

眾所周知，腫瘤的惡性演進(jìn)離不開細(xì)胞異常增殖和細(xì)胞周期的失衡。有關(guān)NCAPD2的研究證實(shí)，其可通過激活mTORC1加快細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變，抑制細(xì)胞自噬，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)[14]。本組對(duì)NCAPD2的生物學(xué)功能進(jìn)行探究，GO富集分析顯示，NCAPD2參與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和細(xì)胞有絲分裂等多種生物學(xué)功能；進(jìn)一步STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析蛋白互作關(guān)系發(fā)現(xiàn)，NCAPD2的互作蛋白主要集中于細(xì)胞周期進(jìn)程相關(guān)蛋白(CDK1、SMC2、SMC4等)。上述研究結(jié)果提示，NCAPD2可能通過調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)HCC的生長(zhǎng)，但其具體分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步分析。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)NCAPD2表達(dá)上調(diào)提示HCC患者預(yù)后不良，且NCAPD2表達(dá)與HCC的惡性程度呈正相關(guān)，可作為評(píng)估HCC患者病情進(jìn)展及預(yù)后的依據(jù)之一，有望成為HCC診斷和預(yù)后的新分子靶標(biāo)。但本研究仍存在不足之處：本次實(shí)驗(yàn)納入的樣本量較少，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證；對(duì)于NCAPD2調(diào)控HCC的分子機(jī)制僅限于數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，并未涉及具體的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，仍有待后續(xù)深入闡釋。