吳春華，周小婷，王 華，2

尤因肉瘤(Ewing sarcoma)是好發(fā)于兒童和青少年骨及軟組織的小圓細胞惡性腫瘤，部分病例在早期階段具有一定轉(zhuǎn)移潛能，有的病例在原發(fā)灶較小時即可出現(xiàn)微轉(zhuǎn)移。盡管手術(shù)、化療及放療能有效治療原發(fā)灶腫瘤，但對轉(zhuǎn)移和復發(fā)患者的療效較差。為改善患者預后，對尤因肉瘤轉(zhuǎn)移的分子機制進行深入研究，尋找其靶向治療相關(guān)的新線索勢在必行。近年，對于尤因肉瘤轉(zhuǎn)移的分子機制研究主要集中在EWS-FLI1融合蛋白、miRNA、細胞骨架分子、Wnt信號通路、血管生成信號通路等方面。

1 EWS-FLI1融合蛋白

尤因肉瘤的重要特征是頻繁出現(xiàn)特異性染色體易位，其中85%的尤因肉瘤存在t(11;22)(q24:q12)，產(chǎn)生EWS-FLI1融合基因，并編碼相應融合蛋白。EWS-FLI1融合蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)下游信號轉(zhuǎn)導分子影響尤因肉瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移[1-2]。EWS-FLI1表達水平的變化使尤因肉瘤細胞表型具有高度可塑性。EWS-FLI1高表達時，細胞具有高增殖潛能；EWS-FLI1低表達時，細胞內(nèi)肌動蛋白結(jié)合蛋白、細胞骨架結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白和整合素明顯上調(diào)，而細胞間黏附蛋白(如緊密連接蛋白、橋粒蛋白)表達下降，導致腫瘤細胞間黏附向細胞與細胞外基質(zhì)黏附轉(zhuǎn)化，細胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移潛能增加[1]。

研究發(fā)現(xiàn)，EWS-FLI1低表達狀態(tài)下，Rho信號通路關(guān)鍵上游調(diào)控因子(如CYR61、CTGF)以及調(diào)控肌動蛋白纖維形成和穩(wěn)定的因子(如TAGLN、CALD-1和TPM-1)表達上調(diào)，進而影響Rho和Hippo信號通路效應子MRTFB和TEAD。MRTFB通過與TEAD相互作用募集到染色質(zhì)中，正向調(diào)控細胞骨架Rho-F肌動蛋白信號通路的基因轉(zhuǎn)錄。在EWS-FLI1負向調(diào)控基因的遠端區(qū)域有MRTFB和TEAD結(jié)合域的富集。EWS-FLI1可結(jié)合到MRTFB遠端區(qū)域，強烈干擾MRTFB的活性。因此，EWS-FLI1可通過干擾MRTFB/TEAD/YAP-1信號通路抑制Rho-肌動蛋白通路，進而抑制細胞骨架的自我調(diào)節(jié)(圖1)[3]。Hippo信號通路的效應子YAP-1/TAZ作為TEAD的輔助因子，在尤因肉瘤中可通過RASSF1C激活，并表現(xiàn)出與EWS-FLI1拮抗的轉(zhuǎn)錄活性。此外，EWS-FLI1可結(jié)合到編碼TAZ的WWTR1基因座上，降低TAZ mRNA的表達[4]。EWS-FLI1低表達時，YAP/TAZ與TEAD的結(jié)合增加，用低濃度YAP抑制劑維替泊芬(VP)處理即可顯著降低腫瘤細胞的遷移能力。RNA-seq全基因轉(zhuǎn)錄組分析顯示，與EWS-FLI1抑制有關(guān)的基因，尤其與細胞骨架、遷移及細胞外基質(zhì)信號傳遞等相關(guān)的基因(如PLAU、FBNI和COL5A1等)顯著富集。同時，F(xiàn)-肌動蛋白和黏著斑的組裝也受到明顯阻斷。在小鼠異種移植模型中，術(shù)前給予不同劑量VP可延遲肺部轉(zhuǎn)移，提示VP對轉(zhuǎn)移潛能的抑制作用[5]。因此，TEAD/YAP-1/TAZ抑制劑有望用于尤因肉瘤的靶向治療和防止轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

圖1 EWS-FLI1對細胞骨架的影響：A. EWS-FLI1高表達時，可通過干擾MRTFB 與TEAD/YAP-1的相互作用，抑制肌動蛋白細胞骨架相關(guān)基因(TAGLN、TPM-1、CALD-1)和細胞外基質(zhì)與受體作用相關(guān)基因(CYR61、CTGF)的表達，進而阻礙細胞骨架組裝；B. EWS-FLI1低表達時，MRTFB/TEAD/YAP-1調(diào)控的細胞骨架相關(guān)因子表達增加，通過Rho通路促進肌動蛋白聚合，最終改變細胞形態(tài)，使其遷移能力增加

2 miRNA

2.1 miRNA-124多種miRNA參與了尤因肉瘤的發(fā)生、發(fā)展或轉(zhuǎn)移等環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-124可負向調(diào)控鋅指轉(zhuǎn)錄抑制因子SNAIL家族成員SLUG的表達，促進細胞間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化，使其遷移和侵襲能力降低。將miRNA-124穩(wěn)定表達的尤因肉瘤細胞A673注入裸鼠的側(cè)尾靜脈，6周后觀察到裸鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)明顯減少，肉瘤細胞中miRNA-124呈高表達，而SLUG和vimentin的表達被抑制[6]。尤因肉瘤中miRNA-124表達受表觀遺傳調(diào)控，用二甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5′-氮-2′-脫氧胞苷和組蛋白脫乙酰化酶抑制劑曲古抑菌素A處理miRNA-124低表達的A673細胞后，細胞的遷移和間充質(zhì)特征明顯受到抑制，提示高甲基化介導了miR-124的低表達狀態(tài)，進而影響尤因肉瘤的間充質(zhì)表型、促進轉(zhuǎn)移[6]。

2.2 miRNA-34miRNA-34家族包括3個成員：miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c。尤因肉瘤中miRNA-34a通常呈低表達，且在轉(zhuǎn)移瘤中的表達水平比原發(fā)灶明顯降低。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-34a表達與Cyclin D1表達呈負相關(guān)。Cyclin D1是尤因肉瘤轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵驅(qū)動因子，其表達受EWS-FLI1正向調(diào)控，參與誘導腫瘤細胞遷移、侵襲、血管生成等與轉(zhuǎn)移相關(guān)的過程。因此，推測miRNA-34a可能通過降低Cyclin D1表達來減弱部分EWS-FLI1的功能，從而發(fā)揮抑制腫瘤的作用[7]。相反，miRNA-34b在尤因肉瘤中呈高表達，且在EWS-FLI1陽性病例中有更高水平的表達。進一步研究表明，miRNA-34b表達受EWS-FLI1融合蛋白的正向調(diào)控，并可結(jié)合NOTCH1的3’-UTR區(qū)直接下調(diào)NOTCH1的表達，在體外實驗中可顯著促進腫瘤細胞的增長、遷移和侵襲能力[8]。

2.3 miRNA-30dmiRNA-30d是新近鑒定的miRNA-30家族成員。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-30d可以抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。Ye等[9]用miRNA-30d轉(zhuǎn)染尤因肉瘤SKES1細胞后，細胞侵襲和遷移能力減弱，同時與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達均明顯降低，表明miRNA-30d過表達可能通過抑制MMP-2和MMP-9表達抑制尤因肉瘤細胞的侵襲和遷移。此外，在miRNA-30d高表達的細胞模型中，p-MEK1/2、p-ERK1/2和p-Akt的表達水平明顯降低，而這些分子的非磷酸化表達水平無明顯改變。提示miRNA-30d作為MEK/ERK和PI3K/Akt途徑上游信號的負向調(diào)節(jié)分子，通過調(diào)控上述分子的磷酸化水平，促進尤因肉瘤細胞S期阻滯和凋亡，從而抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。

2.4 miRNA-130b尤因肉瘤中miRNA-130b可直接靶向抑制Arhgap1的表達[10]；同時Arhgap1又是Cdc42負性調(diào)節(jié)劑，可將活性Cdc42水解為非活性的GDP狀態(tài)。Cdc42作為Rho GTPase家族成員，是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵蛋白，在尤因肉瘤中處于活化狀態(tài)。Arhgap1表達瞬時敲低出現(xiàn)了與miRNA-130b過表達相同的效果，即PAK1和下游分子c-JUN均被明顯激活；而活化的c-JUN可導致轉(zhuǎn)錄因子AP-1活化，并轉(zhuǎn)位到細胞核誘導靶基因如MMP-1、Cyclin D1等的表達，促進轉(zhuǎn)移。進一步研究發(fā)現(xiàn)，AP-1可與miRNA-130b啟動子結(jié)合，經(jīng)激活劑TPA處理后的AP-1，僅4 h就可誘導miRNA-130b前體的轉(zhuǎn)錄，表明miRNA-130b與AP-1之間存在正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。因此，miRNA-130b通過負性調(diào)控尤因肉瘤細胞中Arhgap1的表達，減少Cdc42水解，激活與轉(zhuǎn)移有關(guān)的Cdc42-PAK1-AP-1反饋環(huán)路，最終促進尤因肉瘤轉(zhuǎn)移(圖2)。此外在Cdc42-PAK1-AP-1反饋環(huán)路中，應用PAK1抑制劑可減弱miRNA-130b和AP-1誘導的效應，為抗腫瘤治療靶點研究提供新線索。

圖2 尤因肉瘤中miR-130b/Cdc42/PAK1/AP-1促進轉(zhuǎn)移的正反饋環(huán)路圖

3 Wnt/β-catenin信號通路

在部分尤因肉瘤中，R-脊椎蛋白配體和(或)其細胞表面受體富亮氨酸G蛋白偶聯(lián)受體LGR5呈高表達，兩者可以協(xié)同作用并激活Wnt/β-catenin/TCF及LEF信號通路，促進尤因肉瘤轉(zhuǎn)化成侵襲性表型[11]。Wnt/β-catenin活化細胞中，一些抑制基因與EWS-FLI1誘導基因明顯重疊，而其上調(diào)基因則與EWS-FLI1抑制基因明顯重疊，且EWS-FLI1轉(zhuǎn)錄物及蛋白表達水平均降低，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號與EWS-FLI1表達存在拮抗作用[11]。在EWS-FLI1抑制而Wnt/β-catenin激活的基因中，包括zyxin在內(nèi)的許多細胞骨架基因和腱生蛋白C顯著表達，細胞偽足小體形成增多，擴散、遷移能力增強，小鼠模型中肺部轉(zhuǎn)移也顯著增加[11]。Wnt/β-catenin信號通路可減弱EWS-ETS對Ⅱ型TGF-β受體表達的抑制[12]，此外，還可誘導尤因肉瘤細胞中分泌蛋白發(fā)生改變，特別是促進細胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白的分泌，包括多種與血管基質(zhì)蛋白高度重疊的細胞外基質(zhì)蛋白(如TNC、LUM、MMP-2等)[13]，從而誘導內(nèi)皮細胞增殖，增加腫瘤血管形成[12]。

目前已有針對Wnt通路抑制劑的研發(fā)，如Wnt974，一種特異性?；D(zhuǎn)移酶Porcupine抑制劑。Wnt配體分泌以及與受體的相互作用需要通過Porcupine的棕櫚?；揎棧琖nt974通過抑制Porcupine的作用來抑制Wnt通路的激活。用Wnt974處理尤因肉瘤細胞系后，與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因(如TWIST1、ZEB2和SNAIL1)顯著下調(diào)。雖然Wnt974對小鼠原發(fā)腫瘤的生長無明顯影響，但可延遲轉(zhuǎn)移的發(fā)生，且原發(fā)腫瘤切除后生存期也明顯延長。將Wnt974處理后的尤因肉瘤細胞直接通過尾靜脈注射到血液循環(huán)中，繞過轉(zhuǎn)移級聯(lián)的早期步驟，發(fā)現(xiàn)對小鼠轉(zhuǎn)移瘤形成和生存期無明顯影響，提示W(wǎng)nt974主要在轉(zhuǎn)移早期發(fā)揮抑制作用，從而導致轉(zhuǎn)移延遲[14]。因此，該藥物在尤因肉瘤中具有早期靶向抑制轉(zhuǎn)移形成的特性。

4 CAV1/MEK/ERK/MMP-9信號通路

CAV1(Caveolin-1)是一種多功能支架蛋白，與RNA聚合酶Ⅰ和轉(zhuǎn)錄釋放因子(polymerase Ⅰ and transcription released factor, PTRF)一起形成細胞膜穴樣內(nèi)陷所必需的復合蛋白[15]。研究證實CAV1可通過IQGAP1激活MEK/ERK通路，促進MMP-9表達并調(diào)節(jié)其活性，促進尤因肉瘤細胞的遷移侵襲。CAV1沉默的尤因肉瘤細胞中，核糖體蛋白S6(RPS6)和RSK1磷酸化水平減少，其中RPS6是ERK的下游分子，可以被RSK蛋白磷酸化。在RSK1沉默的細胞模型中，雖然RPS6磷酸化水平和MMP-9的表達和活性未受影響，但細胞遷移和侵襲能力卻明顯降低。敲低RSK1的小鼠模型中，尤因肉瘤肺部轉(zhuǎn)移從83%減少到33.33%[16]，提示RSK1是促進轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子，為針對CAV1誘導的尤因肉瘤轉(zhuǎn)移及其治療提供新的思路，MEK/ERK和RSK1抑制劑有望成為抑制轉(zhuǎn)移的靶向治療藥物。

盡管CAV1在尤因肉瘤細胞中高表達，但腫瘤細胞的細胞膜上卻只有很少的細胞膜穴樣內(nèi)陷形成，這可能與形成細胞膜穴樣內(nèi)陷所必需的另一個分子PTRF低表達有關(guān)。在一項86例尤因肉瘤中的PTRF表達分析顯示，只有38.37%病例PTRF陽性，且PTRF陽性患者的總生存率更高，表明PTRF可能是尤因肉瘤的腫瘤抑制因子和預后標志物。PTRF低表達與CpGs高度甲基化有關(guān)。PTRF和CAV1在尤因肉瘤中呈共定位并相互作用，導致細胞膜穴樣內(nèi)陷形成，細胞凋亡顯著增加，呈p53依賴性。在p53野生型細胞中導入PTRF可引起顯著的細胞凋亡，并可中和CAV1的致癌活性。對于p53野生型尤因肉瘤細胞，使用表觀遺傳學藥物恢復PTRF表達可能成為潛在的治療方法，也可設想將針對PTRF治療與恢復p53活性的藥物結(jié)合起來，治療TP53缺失突變的尤因肉瘤[17]。

5 血管生成

異常血管生成與惡性腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[18]。尤因肉瘤主要以兩種方式形成血管網(wǎng)絡，一種是血管內(nèi)皮細胞增生遷移形成新生血管，另一種是通過腫瘤細胞誘導血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry, VM)。多種因素參與了血管形成的調(diào)節(jié)，如Wnt通路激活可明顯增加血管基質(zhì)蛋白分泌[12]。在血管生成初始階段易發(fā)生缺氧，血管生成通過激活低氧誘導因子誘導VEGF、FGFs和一些趨化因子的表達[19]。此外，抑制元素1-沉默轉(zhuǎn)錄因子(REST)在尤因肉瘤中過表達，并受EWS-FLI1正向調(diào)控，通過CRISPR/Cas9敲除REST基因后，腫瘤在體內(nèi)的生長和向肺部的轉(zhuǎn)移減少，腫瘤血管呈點狀，血管周細胞明顯減少，血管灌注減少，通透性增加，加速缺氧和細胞凋亡[20]。

Eph受體酪氨酸激酶及其膜錨定配體(Ephrins)構(gòu)成最大的受體酪氨酸激酶(RTK)亞家族，是促血管生成的主要RTK家族成員。Ephrins存在時，EphA2與CAV1相互作用，激活AKT信號傳導并促進bFGF表達，誘導內(nèi)皮細胞遷移[21]。多種尤因肉瘤細胞系存在EphA2絲氨酸897位點的磷酸化，通過MEK/ERK途徑，參與尤因肉瘤細胞的遷移。EphA2沉默可引起ERK的磷酸化改變，而更多實驗表明，在EphA2和ERK之間存在相互調(diào)節(jié)反饋環(huán)，EphA2可能作為ERK激酶的下游底物和效應物在尤因肉瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用[22]。

與其它侵襲性腫瘤(如黑色素瘤)相似，尤因肉瘤細胞可分化為具有內(nèi)皮特征的細胞，進而形成豐富的VM。在VM陽性的尤因肉瘤組織中，CD44呈高表達，尤其在血湖(血管生成結(jié)構(gòu))周圍的腫瘤細胞表達更加顯著。CD44作為一種跨膜糖蛋白，通過與透明質(zhì)酸結(jié)合促進細胞與細胞外基質(zhì)的黏附，敲除CD44后，腫瘤細胞的遷移和VM均受到明顯抑制[23]。此外，腫瘤細胞可通過分泌血小板衍生生長因子PDGF-B，募集周細胞并誘導基膜蛋白表達，以維持血管樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定、促進血管出芽[24]。Thijssen等[25]在黑色素瘤小鼠模型中研究顯示，PDGF受體阻斷劑伊馬替尼可有效減少微血管密度和周細胞的數(shù)量。TGF-β家族受體之一的內(nèi)皮糖蛋白是另一種可在腫瘤細胞表面表達的血管生成相關(guān)蛋白。近期Puerto-Camacho等[26]在小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，針對內(nèi)皮糖蛋白的靶向藥OMTX703能有效延緩尤因肉瘤細胞系和患者來源的異種移植瘤的生長。

6 外泌體

外泌體是細胞分泌的細胞外囊泡，直徑30～150 nm，含有DNA、mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)，可以攜帶并輸送功能性小分子物質(zhì)，介導細胞間通訊和調(diào)控腫瘤微環(huán)境，已成為腫瘤研究的熱點。Miller等[27]首次鑒定出尤因肉瘤細胞系衍生的外泌體，發(fā)現(xiàn)其中含有尤因肉瘤特異性EWS-FLI1轉(zhuǎn)錄子及mRNA，并富集了與G蛋白偶聯(lián)信號傳導、神經(jīng)遞質(zhì)信號傳導和干細胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物，提示外泌體可作為尤因肉瘤外周血中最小殘留物的診斷標志物。CD99是尤因肉瘤細胞表面分子標志物，在尤因肉瘤中協(xié)同促進EWS-FLI1的致癌作用、調(diào)控細胞遷移，并能抑制肉瘤細胞的神經(jīng)分化。CD99沉默細胞產(chǎn)生的外泌體可調(diào)節(jié)受體細胞的基因表達，如上調(diào)半乳糖凝集素3結(jié)合蛋白基因、下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子EGR1基因等的表達，這些基因在調(diào)節(jié)尤因肉瘤細胞的侵襲、遷移中起重要作用。最近有研究發(fā)現(xiàn)CD99沉默的細胞通過釋放外泌體，遞送能夠抑制腫瘤細胞惡性生物學行為的miRNA，促進尤因肉瘤受體細胞明顯降低其增殖和遷移能力[28-29]。其中miRNA-34a可抑制NOTCH-NF-κB信號通路，誘導尤因肉瘤細胞的神經(jīng)分化[28]。富集最多的miRNA-199a-3p是抑制尤因肉瘤細胞生長和遷移的關(guān)鍵驅(qū)動因子，在出現(xiàn)肺部或骨轉(zhuǎn)移的患者中明顯少于未轉(zhuǎn)移患者[29]。將尤因肉瘤細胞置于miRNA-199a-3p或富含miRNA-199a-3p的外泌體中，均可以復制CD99沉默細胞來源外泌體的調(diào)節(jié)效應、抑制AP-1活性及其靶基因如MMP-9、MMP-1和CCND1的表達，細胞生長和遷移能力降低，并向神經(jīng)細胞分化。上述研究提示外泌體在腫瘤細胞的生命活動中起非常重要的作用，深入研究其在修飾尤因肉瘤相關(guān)微環(huán)境及發(fā)展中的作用，將為腫瘤治療提供更多新途徑。

7 結(jié)語

綜上，近年對尤因肉瘤轉(zhuǎn)移機制的研究，包括miRNA、Wnt信號通路、血管形成以及外泌體等方面取得了一些進展，對闡明尤因肉瘤轉(zhuǎn)移的分子機制、尋找新的靶向治療藥物奠定了基礎。由于尤因肉瘤轉(zhuǎn)移患者的治療效果和預后尚不理想，與轉(zhuǎn)移相關(guān)的一些具體機制仍不十分清楚。因此深入分析尤因肉瘤轉(zhuǎn)移中涉及的信號轉(zhuǎn)導通路、微環(huán)境調(diào)控、聯(lián)合靶向藥物等問題，將為尤因肉瘤的治療帶來新希望。