朱 蘋(píng)，黃月盈，康桂鈺，郟雁飛，張 倩，賈 穎，焦 瑒，馬曉麗，

肺癌是全球病死率較高的惡性腫瘤之一，其中肺腺癌是最常見(jiàn)的組織類型[1]。吸煙是誘導(dǎo)肺腺癌發(fā)生、發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素之一[2]，煙草中使人成癮的尼古丁與肺癌細(xì)胞表面的尼古丁乙酰膽堿受體蛋白(nicotinic acetylcholine receptor, nAChR)結(jié)合，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管新生[3-4]。全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association studies, GWAS)分析顯示，15號(hào)染色體長(zhǎng)臂上編碼α3、α5和β4尼古丁乙酰膽堿受體的基因簇為人類肺癌易感性基因座，與肺癌發(fā)展有密切的聯(lián)系[5-6]。nAChR的激活可以刺激血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、表皮生長(zhǎng)因子和花生四烯酸釋放，促進(jìn)多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展[7-8]。在健康人中，VEGF參與傷口愈合和血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)。研究表明，VEGF促進(jìn)腫瘤血管和淋巴管生成，VEGF高表達(dá)提示患者預(yù)后不良[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)CHRNA5基因(編碼α5-nAChR蛋白)表達(dá)抑制尼古丁促肺癌細(xì)胞增殖，降低VEGF表達(dá)[10]，α5-nAChR/HIF-1α/VEGF軸參與尼古丁誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖[11]，但尚未研究α5-nAChR對(duì)血管形成的影響，且未通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘分析兩者的相關(guān)性及臨床意義。本文應(yīng)用多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)、免疫組化及血管形成實(shí)驗(yàn)分析α5-nAChR、VEGF在肺腺癌的表達(dá)相關(guān)性及α5-nAChR對(duì)血管形成的影響，旨在預(yù)測(cè)肺腺癌侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后的分子標(biāo)志物，改善患者的生存率。

1 材料與方法

1.1 材料A549細(xì)胞和HUVEC購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；廣州銳博公司合成si-CHRNA5；肺癌組織芯片(HLug-Ade150Sur-02)購(gòu)自上海芯超公司，其中包含57例肺腺癌患者的癌組織和癌旁組織；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和opti-MEM購(gòu)自Invitrogen公司；Matrigel膠購(gòu)自BD公司；細(xì)胞骨架分析試劑盒購(gòu)自Thermo公司；α5-nAChR抗體購(gòu)自Abcam公司；VEGF抗體購(gòu)自福州邁新公司；免疫組化染色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1數(shù)據(jù)庫(kù)分析 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)置檢索參數(shù)，Oncomine(https://www.oncomine.org/resource/main.html)分析肺腺癌中CHRNA5和VEGF基因表達(dá)；GEPIA(http://xena.ucsc.edu)分析兩者在肺腺癌中表達(dá)的相關(guān)性；Kaplan-Meier Plotter(https://kmplot.com/analysis/)分析兩者表達(dá)與患者總生存期(overall survival, OS)的關(guān)系。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 A549細(xì)胞置于10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，經(jīng)5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照siRNA產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)操作，轉(zhuǎn)染48 h后備用。實(shí)驗(yàn)設(shè)立對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組。

1.2.3血管形成實(shí)驗(yàn) 在預(yù)冷的96孔板鋪上Matrigel，每孔70 μL，37 ℃培養(yǎng)箱中凝固30 min，備用。消化HUVEC細(xì)胞，按照分組以腫瘤細(xì)胞上清液重懸，每孔加入100 μL，其中包含2×104個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，拍照觀察小管形成情況。

1.2.4免疫組化 免疫組化染色使用非生物素PV兩步法檢測(cè)系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，其中檢測(cè)α5-nAChR的組織芯片使用檸檬酸鹽溶液修復(fù)，檢測(cè)VEGF的組織芯片使用EDTA溶液修復(fù)，抗體稀釋比：α5-nAChR為1 ∶500、VEGF為1 ∶2 500。結(jié)果判定：(1)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，<25%為1分，25%～75%為2分，>75%為3分。將兩項(xiàng)評(píng)分相乘作為最終評(píng)分：≥4分為陽(yáng)性，<4分為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析血管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用t檢驗(yàn)，Oncomine對(duì)符合篩選條件的數(shù)據(jù)集進(jìn)行Meta分析，GEPIA使用Pearson檢驗(yàn)分析CHRNA5、VEGF mRNA表達(dá)的相關(guān)性。其余數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，其中α5-nAChR、VEGF表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)，預(yù)后分析采用Kaplan-Meier生存曲線。

2 結(jié)果

2.1 Oncomine中CHRNA5、VEGF在肺腺癌組織與正常肺組織的表達(dá)差異應(yīng)用Oncomine對(duì)符合篩選條件的數(shù)據(jù)集進(jìn)行Meta分析，3個(gè)芯片數(shù)據(jù)集顯示：CHRNA5在肺腺癌組織中高表達(dá)，中位數(shù)排序1 252.0，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1A)；VEGF在肺腺癌組織中高表達(dá)，中位數(shù)排序429.0，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1B)。

圖1 Oncomine中CHRNA5、VEGF在肺腺癌組織與正常肺組織中的表達(dá)差異：A.CHRNA5表達(dá)差異的Meta分析；B.VEGF表達(dá)差異的Meta分析

2.2 CHRNA5和VEGF的相關(guān)性GEPIA相關(guān)性分析顯示，CHRNA5與VEGF基因表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05，圖2A)。

2.3 CHRNA5、VEGF表達(dá)與肺腺癌患者生存期的關(guān)系Cox回歸模型繪制Kaplan-Meier生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)顯示CHRNA5高表達(dá)組患者生存率(HR=2.49，P<0.05，圖2B)和VEGF高表達(dá)組患者生存率(HR=2.8，P<0.05，圖2C)分別顯著低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 CHRNA5與VEGF表達(dá)相關(guān)性及兩者表達(dá)與患者生存期的關(guān)系：A.CHRNA5與VEGF表達(dá)相關(guān)性；B.CHRNA5與肺腺癌患者總生存期的關(guān)系；C.VEGF與肺腺癌患者總生存期的關(guān)系

2.4 干擾CHRNA5基因?qū)ρ苄纬赡芰Φ挠绊懷苄纬蓪?shí)驗(yàn)顯示：干擾A549細(xì)胞CHRNA5后，干擾組HUVEC血管形成能力降低，平均管主干長(zhǎng)度計(jì)數(shù)和平均管結(jié)點(diǎn)計(jì)數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05，圖3)。

圖3 干擾CHRNA5基因?qū)ρ苄纬赡芰Φ挠绊懀篈.對(duì)照組；B.干擾組；C.平均管主干長(zhǎng)度計(jì)數(shù)；D.平均管結(jié)點(diǎn)計(jì)數(shù)；*P<0.05

2.5 肺腺癌組織中α5-nAChR、VEGF表達(dá)的相關(guān)性免疫組化標(biāo)記α5-nAChR與VEGF陽(yáng)性均定位于胞質(zhì)，為棕褐色顆粒(圖4)。57例肺腺癌石蠟樣本中α5-nAChR陽(yáng)性33例(57.89%)，VEGF陽(yáng)性45例(78.95%)，α5-nAChR、VEGF共同陽(yáng)性26例(45.61%)，α5-nAChR、VEGF共同陰性5例(8.77%)。χ2檢驗(yàn)結(jié)果表明α5-nAChR和VEGF表達(dá)存在相關(guān)性(P<0.05，表1)。

表1 肺腺癌組織中α5-nAChR、VEGF表達(dá)的相關(guān)性

圖4 肺腺癌及癌旁組織中α5-nAChR、VEGF的表達(dá)，PV兩步法

2.6 肺腺癌中α5-nAChR、VEGF表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系肺腺癌中，α5-nAChR表達(dá)與患者性別(P=0.039)和AJCC臨床分期(P=0.008)有關(guān)，與患者年齡(P=0.294)和病理分級(jí)(P=0.948)無(wú)關(guān)；VEGF表達(dá)與患者性別(P=1.000)、年齡(P=0.099)、病理分級(jí)(P=0.736)、AJCC臨床分期(P=0.171)無(wú)關(guān)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 肺腺癌中α5-nAChR、VEGF表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.7 α5-nAChR、VEGF表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系根據(jù)免疫組化結(jié)果將57例肺腺癌患者分為4組：α5-nAChR陽(yáng)性組(α5-nAChR+)、α5-nAChR陰性組(α5-nAChR-)、VEGF陽(yáng)性組(VEGF+)、VEGF陰性組(VEGF-)。Kaplan-Meier生存曲線顯示α5-nAChR、VEGF同時(shí)陽(yáng)性與兩者同時(shí)陰性患者相比，其預(yù)后水平差、5年生存率低(圖5)。

圖5 α5-nAChR、VEGF表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系：A. α5-nAChR表達(dá)與肺腺癌患者總生存期的關(guān)系；B. VEGF表達(dá)與肺腺癌患者總生存期的關(guān)系；C. α5-nAChR和(或)VEGF表達(dá)與肺腺癌患者總生存期的關(guān)系

3 討論

吸煙是肺癌和慢性阻塞性肺疾病的主要危險(xiǎn)因素之一，GWAS顯示染色體區(qū)域15q25上的基因簇與尼古丁、肺癌等肺疾病的易感性增加密切相關(guān)[12-13]。研究表明，尼古丁促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株α5-nAChR蛋白及CHRNA5的表達(dá)并激活JAK/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[14]，干擾α5-nAChR表達(dá)能顯著降低尼古丁促肺癌細(xì)胞遷移及侵襲的能力[15]，α5-nAChR通過(guò)STAT3/Jab1信號(hào)軸介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[16]。目前，α5-nAChR在肺癌發(fā)生及發(fā)展中的分子機(jī)制尚不清楚。

血管生成在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中至關(guān)重要，臨床通過(guò)阻斷這一途徑治療腫瘤[17]。近年以VEGF為靶點(diǎn)的抗血管生成藥物在我國(guó)獲批用于治療晚期NSCLC。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，α5-nAChR與VEGF的表達(dá)密切相關(guān)，因此探討α5-nAChR和VEGF在肺腺癌中的表達(dá)、生存預(yù)后及α5-nAChR對(duì)血管形成的影響，對(duì)NSCLC評(píng)估及治療具有臨床意義。

本組通過(guò)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置CHRNA5和VEGF差異表達(dá)的篩選條件，數(shù)據(jù)集分析顯示，CHRNA5和VEGF mRNA在肺腺癌組織中高表達(dá)。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示兩者在肺腺癌中mRNA表達(dá)呈正相關(guān)。GEO等數(shù)據(jù)庫(kù)生存曲線表明，高表達(dá)CHRNA5或VEGF基因的患者預(yù)后差，生存率顯著降低。血管形成實(shí)驗(yàn)證明α5-nAChR促進(jìn)腫瘤血管生成。免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織芯片癌組織中α5-nAChR、VEGF表達(dá)高于癌旁組織，且兩者表達(dá)存在相關(guān)性(P<0.05)。分析α5-nAChR、VEGF表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系表明：α5-nAChR表達(dá)與患者性別和臨床分期有關(guān)，可能與不同人群的吸煙史及腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。有研究表明，VEGF表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)，本組VEGF表達(dá)與患者性別、年齡、病理分級(jí)、腫瘤臨床分期無(wú)關(guān)，其表達(dá)在肺腺癌中的機(jī)制有待進(jìn)一步分析[18-20]。本組數(shù)據(jù)庫(kù)生存曲線表明：VEGF或CHRNA5基因高表達(dá)患者的預(yù)后不良，可能是尼古丁結(jié)合α5-nAChR促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，而VEGF高表達(dá)患者的腫瘤微血管密度增加及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)增高，影響患者的生存期。臨床病理組織芯片中患者生存曲線顯示，僅α5-nAChR高表達(dá)顯示患者生存率顯著降低(P<0.05)；VEGF高表達(dá)或α5-nAChR、VEGF同時(shí)高表達(dá)患者與VEGF低表達(dá)或α5-nAChR、VEGF同時(shí)低表達(dá)患者的生存曲線相比，有明顯的下降及分離趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能與樣本量過(guò)少有關(guān)，后期可通過(guò)增加樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。本課題組前期研究結(jié)果顯示尼古丁可以結(jié)合α5-nAChR激活JAK/STAT3信號(hào)通路參與肺癌細(xì)胞增殖；同時(shí)有其它研究表明[21]，催乳素通過(guò)上調(diào)生長(zhǎng)激素受體和激活JAK2/STAT3/VEGF通路的下游，促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549的增殖。由此表明肺腺癌中α5-nAChR/STAT3/VEGF信號(hào)通路參與肺癌的發(fā)生。本組檢索JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，STAT3在CHRNA5和VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)域均存在結(jié)合位點(diǎn)，需對(duì)α5-nAChR與VEGF在肺腺癌中的相關(guān)性進(jìn)一步分析。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，α5-nAChR、VEGF在肺腺癌中表達(dá)上調(diào)，且兩者表達(dá)呈正相關(guān)，并影響患者預(yù)后及體外血管生成，但其分子作用機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步探索及驗(yàn)證，兩者有望成為肺腺癌預(yù)后的分子標(biāo)志物。