柯 野, 謝天涵, 梅穎詩, 張 敏, 黃 湘, 屈奇奇

(韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005)

隨著現(xiàn)代養(yǎng)殖畜牧業(yè)的迅速發(fā)展，其帶來的不僅是環(huán)境污染問題，同時(shí)伴隨著許多廢棄物的產(chǎn)生，這些廢棄物的無害處理以及回收利用越來越受到人們的關(guān)注，如家禽屠宰后的毛發(fā)處理就是一個(gè)需待解決的問題.羽毛本身是一種豐富的蛋白質(zhì)資源[1]，但其利用率低，在生產(chǎn)實(shí)踐上通常采用焚燒、填埋或高溫降解等方式進(jìn)行簡單處理，這些方式不僅不能充分利用羽毛中的豐富蛋白質(zhì)資源，同時(shí)造成的環(huán)境問題令人堪憂[2].動(dòng)物毛發(fā)，尤其是家禽羽毛，富含蛋白質(zhì)高達(dá)80%，其中大部分由角蛋白質(zhì)組成[3].角蛋白不溶于水，有較好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[4]，導(dǎo)致不易被降解，因此，羽毛蛋白質(zhì)資源的難以利用是現(xiàn)今需待解決的問題.目前越來越多的研究開始探索對(duì)羽毛廢棄物的高價(jià)值利用，在對(duì)羽毛開發(fā)利用的各種方法中，生物酶法是最安全、經(jīng)濟(jì)、對(duì)環(huán)境無污染的方法，但生物酶法存在處理周期長、酶穩(wěn)定性差、降解效率低等問題，這些問題是對(duì)解決羽毛高值化利用的關(guān)鍵所在.就提高生物酶對(duì)羽毛的高效降解，首先，應(yīng)篩選獲得對(duì)羽毛降解效率高的酶，但目前市場上對(duì)羽毛降解的酶效率不高，因此，從微生物中篩選出能分泌大量高效降解羽毛的降解酶的微生物，是一種解決羽毛降解的最佳途徑之一[5].

目前已從自然界篩選獲得了細(xì)菌、放線菌和霉菌，共計(jì)30多種對(duì)羽毛具有降解作用的微生物；在這些微生物中，霉菌雖然能產(chǎn)生角蛋白酶，但這些角蛋白酶具有一定的致病性，因此，較多研究者主要專注于細(xì)菌和放線菌產(chǎn)生的角蛋白酶.但對(duì)于目前獲得的羽毛降解菌而言，大多數(shù)菌株對(duì)羽毛降解效率低，投入到實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用還有較大的差距.本研究旨在尋找高效降解羽毛的菌株，研究其產(chǎn)生的蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)，使其為羽毛的高效降解和高值化開發(fā)利用提供一定的技術(shù)參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 羽毛降解菌分離于羽毛廢棄物的排水溝污泥中.

1.1.2 培養(yǎng)基 羽毛粉固體培養(yǎng)基含1.5 g·L-1K2HPO4、0.025 g·L-1MgSO4·7H2O、0.015 g·L-1FeSO4、0.025 g·L-1無水CaCl2、10.0 g·L-1羽毛粉、20.0 g·L-1瓊脂、1 L蒸餾水，pH自然.

富集培養(yǎng)基含0.1 g·L-1MgCl2·7H2O、0.5 g·L-1NaCl、0.4 g·L-1KH2PO4、0.5 g·L-1NH4Cl、0.3 g·L-1K2HPO4、1.0 g·L-1酵母提取物、10.0 g·L-1羽毛粉、少許完整的羽毛，pH自然.

羽毛發(fā)酵培養(yǎng)基的各種成分與羽毛粉固體培養(yǎng)基相同，僅用50.0 g·L-1羽毛代替羽毛粉，無瓊脂.

1.1.3 試劑 甘氨酸、酪氨酸、谷氨酸購自上海展云化工有限公司；高效薄層層析硅膠板HSGF254(5×10)購自煙臺(tái)江支硅膠開發(fā)有限公司；纈氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸購自廣州普博欣生物科技有限公司；其他試劑均為分析純.

1.2 菌株的分離篩選

1.2.1 菌株的富集、分離和純化 將采集的污泥樣品，接種少許于富集培養(yǎng)基中，于28℃、160 r·min-1培養(yǎng)3 d；將適量富集液涂布在羽毛粉固體培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)5～7 d后挑取長勢良好的菌株，通過多次劃線分離，直至獲得純化的菌株，保存?zhèn)溆?

1.2.2 菌株的發(fā)酵篩選 將各個(gè)菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基(50 mL·瓶-1)中，于28 ℃、160 r·min-1活化2 d后接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、160 r·min-1培養(yǎng)7 d；用濾紙過濾，稱量烘干至恒重的殘余羽毛；采用失重法計(jì)算降解率，即羽毛降解率/%=[(發(fā)酵培養(yǎng)基中的羽毛干重-發(fā)酵后羽毛殘?jiān)芍?/發(fā)酵培養(yǎng)基中的羽毛干重]×100.

1.3 RM菌株的鑒定

1.3.1 RM菌株的形態(tài)特征 將羽毛降解效果最佳的RM菌株接種于LB平板上，于28 ℃培養(yǎng)2 d，觀察菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu).

1.3.2 RM菌株16S rDNA的分子鑒定 參照玻璃珠法[6]提取RM菌株的基因組，稍有改動(dòng)：1.0 mL過夜培養(yǎng)的菌液于12 000 r·min-1離心2～3 min，棄上清后，菌體沉淀重懸于STES緩沖液中，加入酸洗玻璃珠和TE緩沖液，再加入酚·氯仿振蕩4 min，于12 000 r·min-1離心5 min，收集上清加入2.5倍體積的無水乙醇和0.1倍體積的乙酸鈉，于12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min后，棄上清，加入70%乙醇洗滌DNA沉淀，離心5 min后，去掉上清，待乙醇室溫?fù)]發(fā)完后用TE緩沖液溶解基因組DNA.將基因組DNA送往生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行全基因組測序.根據(jù)測序結(jié)果，分析其16S rDNA序列，將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行比對(duì)分析.

1.3.3 RM菌株生理生化特性的鑒定 對(duì)RM菌株進(jìn)行多種生理生化試驗(yàn)，試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[7].

1.4 羽毛含量對(duì)降解效果影響的試驗(yàn)

分別配制不同羽毛含量(1%、2%、4%、6%、8%、10%)的發(fā)酵培養(yǎng)基，接種RM菌株菌懸液1 mL(接種量1%)，于28 ℃、160 r·min-1培養(yǎng)7 d，測定RM菌株對(duì)不同羽毛含量的降解效果.

1.5 發(fā)酵天數(shù)對(duì)降解效果影響的試驗(yàn)

將RM菌株按1.0%(V/V)的接種量接種至裝有100 mL 4%羽毛含量的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、160 r·min-1搖床培養(yǎng)，取不同培養(yǎng)時(shí)間段(3、4、5、6、7、8、9 d)的發(fā)酵液，測定羽毛的降解率.

1.6 羽毛降解液中氨基酸的層析

對(duì)培養(yǎng)8 d的發(fā)酵液進(jìn)行過濾，濾液于11 000 r·min-1離心10 min，收集上清.上清于60 ℃恒溫干燥濃縮后加入2.5倍的無水乙醇，于-20 ℃放置沉淀30 min，再于11 000 r·min-1離心10 min，收集上清，進(jìn)行薄層色譜法層析試驗(yàn).配制展開劑(正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶2)，在商業(yè)硅膠板上進(jìn)行薄層色譜法層析，用茚三酮顯色觀察氨基酸的層析結(jié)果.

1.7 發(fā)酵液中粗酶液性質(zhì)的測定

1.7.1 粗酶液的制備及酶活性的測定 收集發(fā)酵培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液，過濾收集濾液，濾液于11 000 r·min-1離心10 min去除沉淀，收集上清，即為粗酶液.向粗酶液中添加(NH4)2SO4，使其飽和度達(dá)到80%以上，于4 ℃過夜鹽析后，再于11 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，收集沉淀，用蒸餾水溶解，于透析袋(4 ℃)透析獲得粗酶液，置4 ℃冷藏保存?zhèn)溆?按Folin-酚法[8]測定粗酶液的酶活性.

1.7.2 最適反應(yīng)溫度和最適pH的確定 測定粗酶液在30～60 ℃不同反應(yīng)溫度的酶活性，以確定最適反應(yīng)溫度；測定粗酶液在不同反應(yīng)pH為8.0～12.5的酶活性，以確定最適合反應(yīng)的pH.

1.7.3 金屬離子和抑制劑對(duì)酶活性的影響 向粗酶液中分別添加不同的金屬離子(Mg2+、Ni2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+)和蛋白酶抑制劑(苯甲基磺酰氟、亮抑蛋白酶肽、乙二胺四乙酸)，于4 ℃處理24 h后，測定其殘余的酶活性.以超純水代替含有金屬離子或抑制劑的粗酶液作為對(duì)照.

1.7.4 不同酶液對(duì)不同底物的降解效果 分別向含有1 U·mL-1木瓜蛋白酶、粗酶液的溶液中添加羽毛、豬毛、頭發(fā)等不同的毛類底物(底物含量均為4.0%)，于37 ℃酶解2 d后，測定底物的降解率.

2 結(jié)果與分析

2.1 羽毛降解菌株的分離篩選結(jié)果

將污泥樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)后，在羽毛粉平板上多次劃線分離，共獲得13株長勢較好的菌株.對(duì)這13株菌株進(jìn)行液體發(fā)酵后，比較其降解率，其中，RM菌株的降解率最高.因此，本研究選取RM菌株作為研究對(duì)象.

2.2 RM菌株的分類鑒定結(jié)果

2.2.1 RM菌株的形態(tài)特征 RM菌株在LB固體培養(yǎng)基上的形態(tài)如圖1所示.由圖1可見，RM菌株的單菌落呈圓形隆起，鮮紅色，濕潤透明，易被接種環(huán)挑起.RM菌株的顯微結(jié)構(gòu)如圖2所示.由圖2可見，RM菌呈短桿形狀，革蘭氏染色為陽性.

圖1 RM菌株的菌落形態(tài)

2.2.2 RM菌株16S rDNA序列的比對(duì)結(jié)果 將RM菌株基因組測序結(jié)果提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(Accession：QYCQ00000000.1)，分析獲得了RM菌株16S rDNA序列，將該序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中通過BLAST 2.12.0在線軟件獲得同源性高的16S rDNA序列.用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA 5.10進(jìn)行發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果如圖3所示.由圖3可知，RM菌株與D.saudiensisstrain YIM F302(Accession：NR_153717.1)、D.arenaestrain SA1(Accession：NR_146665.1)、D.actinosclerusstrain BM2(Accession：NR_148665.1)、D.hibiscistrain THG-AG1.5(Accession：NR_159297.1)的同源性高，親緣關(guān)系近.因此，初步可知RM菌株屬于異常球菌屬(Deinococcus).

圖3 RM菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.3 RM菌株的生理生化特性 RM菌株一系列生理生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，RM菌株為革蘭氏陽性菌，無運(yùn)動(dòng)性，為好氧微生物.在淀粉水解、接觸酶、硫化氫、明膠水解、硝酸鹽還原及呼吸、油脂水解、吐溫-80水解的試驗(yàn)中均呈陽性；在氧化酶、脲酶、糖(葡萄糖、蔗糖)發(fā)酵的試驗(yàn)中均呈陰性.結(jié)合RM菌株的形態(tài)結(jié)構(gòu)、分子鑒定結(jié)果和生理生化特性參考相關(guān)文獻(xiàn)[9]初步鑒定RM菌株為D.actinosclerus.

2.3 羽毛含量對(duì)降解效果的影響

由表1可知：RM菌株對(duì)不同羽毛含量降解效率的差異顯著，羽毛含量越低，降解效果越強(qiáng)；羽毛含量越高，降解效果不佳.該結(jié)果與相關(guān)報(bào)道的“當(dāng)羽毛粉含量高于1.5%時(shí)，菌株產(chǎn)生的胞外蛋白酶被抑制，導(dǎo)致羽毛粉的降解效率下降”[10]相一致.因此，本研究結(jié)合發(fā)酵成本與降解效果，選擇4.0%作為最適羽毛含量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).

表1 羽毛含量對(duì)羽毛降解效果的影響

2.4 發(fā)酵天數(shù)對(duì)降解效果的影響

由表2可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，羽毛降解率不斷升高，第7天后趨于穩(wěn)定，高于60%.

2.5 羽毛降解液中氨基酸的層析結(jié)果

羽毛降解液中氨基酸的層析結(jié)果如圖4所示.由圖4可知，羽毛被降解后，水解產(chǎn)物含有半胱氨酸、酪氨酸、脯氨酸、絲氨酸、甲硫氨、谷氨酸等多種氨基酸，該結(jié)果與林香信等[11]測定的羽毛氨基酸成分相一致.由此可知，羽毛已被RM菌株降解.

圖4 羽毛降解液中氨基酸的薄層色譜法層析圖

2.6 粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)

2.6.1 最適反應(yīng)溫度和最適pH 粗酶液的最適反應(yīng)溫度和最適pH分別見圖5和圖6.由圖5可見：蛋白酶最適反應(yīng)溫度為45 ℃;當(dāng)溫度低于40 ℃或高于55 ℃，酶活性顯著下降，達(dá)不到最適反應(yīng)溫度相對(duì)活性的80%，這表明反應(yīng)溫度對(duì)酶活性的影響極顯著.由圖6可見：隨著反應(yīng)液pH的升高，酶活性逐漸提高，最適pH為10.0; 當(dāng)反應(yīng)pH高于10.0時(shí)，酶活性下降，這表明酶活性受pH的影響顯著，粗酶液中的蛋白酶以堿性蛋白酶為主.

圖5 溫度對(duì)粗酶液酶活性的影響

2.6.2 金屬離子和抑制劑對(duì)酶活性的影響 不同金屬離子和抑制劑對(duì)粗酶液酶活性的影響如表3所示.由表3可知，Mg2+、Cu2+對(duì)酶活性有輕微的促進(jìn)作用，而Ca2+、Ni2+、Zn2+對(duì)酶活性有抑制作用，其中，Ni2+、Zn2+的抑制作用較為明顯.抑制劑對(duì)酶活性均有一定程度的抑制性.其中，苯甲基磺酰氟對(duì)酶活性有非常顯著的抑制性，相對(duì)酶活性僅剩下31.8%，這表明粗酶液的蛋白酶以絲氨酸蛋白酶為主；亮抑蛋白酶肽對(duì)酶活性的抑制效果不顯著，這表明粗酶液可能有少量的半胱氨酸；而胃蛋白酶抑制劑的抑制效果稍明顯，相對(duì)酶活性為79.87%，這表明粗酶液可能含有天冬氨酸蛋白酶.

表3 金屬離子和抑制劑對(duì)粗酶液酶活性的影響

2.6.3 不同酶液對(duì)不同底物的降解效果 降解后的羽毛較多呈顆粒粘稠狀，頭發(fā)和豬毛多呈斷裂狀.由表4可知：相較于木瓜蛋白酶,粗酶液對(duì)羽毛、頭發(fā)、豬毛的降解率均更高，表明粗酶液對(duì)于商業(yè)化的木瓜蛋白酶有更好的降解效果.

表4 不同酶液對(duì)不同底物的降解率

3 結(jié)論

目前已有利用微生物降解羽毛的相關(guān)報(bào)道，但絕大多數(shù)分離獲得的微生物，在羽毛較低的含量下才有較高的降解率.如吳小倫[12]分離的羽毛降解菌株ZDM在含有2.0%羽毛粉中，培養(yǎng)3 d后達(dá)到最大降解率，僅為55.9%；王繼勇等[13]分離的羽毛降解菌株在1%羽毛粉中，培養(yǎng)4 d后達(dá)到最大降解率，僅為71.3%.本研究分離的RM菌株，對(duì)4.0%羽毛粉有高達(dá)64.0%的降解率，這表明該菌株比目前報(bào)道的多數(shù)菌株都具有較強(qiáng)的應(yīng)用潛力.對(duì)RM菌株進(jìn)行形態(tài)特征觀察，將其16S rDNA序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對(duì)分析，進(jìn)一步通過生理生化試驗(yàn)初步鑒定出RM菌株為D.actinosclerus.

Mg2+、Cu2+對(duì)RM菌株產(chǎn)生的蛋白酶活性有促進(jìn)作用，而Ca2+、Ni2+、Zn2+、苯甲基磺酰氟、乙二胺四乙酸、亮抑蛋白酶肽對(duì)酶活性有抑制作用.由此可推測，金屬離子可能對(duì)酶的空間結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)具有一定的影響，導(dǎo)致其活性發(fā)生改變.除此之外，苯甲基磺酰氟是常見的絲氨酸蛋白酶抑制劑，對(duì)酶活性有顯著的抑制性，同時(shí)粗酶液的最適反應(yīng)溫度為45 ℃，最適pH為10.0，因此可推測該菌株產(chǎn)生的酶可能屬于絲氨酸蛋白酶.該酶與商業(yè)化的木瓜蛋白酶相比，對(duì)羽毛有更強(qiáng)的水解能力，羽毛水解產(chǎn)物中含有多種氨基酸.因此，該菌株以及所產(chǎn)生的胞外蛋白酶無論是在理論研究，還是應(yīng)用前景方面，都有一定的研究價(jià)值，今后可從酶基因的克隆表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能以及對(duì)羽毛的降解機(jī)理等方面進(jìn)行更深入研究.