黃思娟, 黃崇銀, 曹俊杰, 王 永, 劉兆穎

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省獸藥工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

鉤吻[Gelsemiumelegans(Gardn.& Champ.)Benth.]為馬錢科胡蔓藤屬植物，分布于我國(guó)廣西、福建、浙江等地[1].鉤吻一直作為我國(guó)傳統(tǒng)的中草藥被世人所知，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎鎮(zhèn)痛、促生長(zhǎng)等多種藥理作用[2].但鉤吻毒性極強(qiáng)，毒性劑量與有效治療劑量相接近，誤食后極易引起中毒，故一般以外用為主.鉤吻中毒后，臨床表現(xiàn)以消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主[3-4].盡管鉤吻毒性極大，但有記載表明，食用鉤吻對(duì)羊、豬等動(dòng)物具有促生長(zhǎng)功效[5-6].

近年來，從鉤吻中提取出了200多種生物堿，其中，鉤吻素子和鉤吻素甲為其主要活性成分[7].鉤吻素子在機(jī)體內(nèi)迅速、廣泛分布，大鼠靜脈注射后，可以在各個(gè)組織中被檢測(cè)到，其中在腎臟中有較高的藥物濃度，腎臟排泄或許是其主要的排泄途經(jīng)[8].魏文增等[9]對(duì)鉤吻素子在人和多種試驗(yàn)動(dòng)物的肝微粒體體外代謝的差異進(jìn)行比較，結(jié)果表明，在人體中的相對(duì)降解量最低，僅代謝22.28%.鉤吻生物堿在人體內(nèi)緩慢消除，其代謝產(chǎn)物和代謝率等也不同，這或許是鉤吻對(duì)人體產(chǎn)生毒性反應(yīng)的原因之一[10].腎臟是機(jī)體內(nèi)重要的代謝和排泄組織，對(duì)于研究藥物的代謝以及藥物之間的相互作用具有重要意義，但有關(guān)服用鉤吻后對(duì)腎臟代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)影響的研究很少.因此，本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)豬腎臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，旨在探究鉤吻對(duì)豬腎臟代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)的影響.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選購(gòu)湖南新五豐永安分公司的健康雄性去勢(shì)二元雜種(長(zhǎng)白豬×大白豬)斷奶仔豬(60日齡左右)，體重(20±2)kg，共10頭.

1.1.2 主要試劑 Trizol試劑盒(TruSeq RNA LT Sample Prep Kit v2)、測(cè)序試劑1(TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS)、測(cè)序試劑2[TruSeq SBS Kit v3-HS(200-cycles)]均為美國(guó)Illumina公司產(chǎn)品；捕獲磁珠(AmpureBeads)、磁珠(AmpureBeads)均為美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品；Qubit定量試劑盒(Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)為美國(guó)Life公司產(chǎn)品.

1.1.3 主要儀器 Hiseq 2000高通量測(cè)序儀、CBOT簇生成儀均為美國(guó)Illumina公司產(chǎn)品；冷凍離心機(jī)為美國(guó)Scan Speed公司產(chǎn)品；分光光度計(jì)、濃縮儀、常溫離心機(jī)均為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；Qubit為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)均為中國(guó)天能公司產(chǎn)品；超聲波破碎儀為比利時(shí)Biorupter公司產(chǎn)品；漩渦混合儀(vortex-genie2)為美國(guó)SI公司產(chǎn)品；搖床、磁力架均為中國(guó)智城公司產(chǎn)品；移液器為德國(guó)Eppendrof公司產(chǎn)品；普通PCR儀為美國(guó)Life公司產(chǎn)品.

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 將10頭仔豬隨機(jī)分為對(duì)照組和給藥組兩組.對(duì)照組飼喂不含抗菌藥物的全價(jià)日糧(日糧購(gòu)自湖南新五豐永安分公司)，給藥組飼喂不含抗菌藥物的全價(jià)日糧+2%鉤吻全草粉末(全草粉末購(gòu)自福建省)，每組5頭，單欄飼養(yǎng).連續(xù)飼養(yǎng)45 d后停止給藥，所有仔豬禁食24 h，于停藥1 d后，在遵循動(dòng)物福利剖解程序的情況下放血處死，繼而解剖，快速采集各組仔豬的腎組織，置入蒸餾水中清洗后放入凍存管，用封口膜封好，并迅速置于液氮中速凍，再轉(zhuǎn)入冰箱(-80 ℃)中冷凍保存，每組隨機(jī)挑選3份組織樣本進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序.

1.2.2 總RNA提取與質(zhì)量檢測(cè) 用Trizol法提取腎臟組織總RNA；用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性(28S∶18S≥1.5)，用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度(D260 nm∶D280 nm為1.8～2.2)，用Qubit 2.0精確定量RNA濃度.在RNA提取前，對(duì)操作過程中用到的所有器械進(jìn)行去RNA酶處理.

1.2.3 測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建 總RNA樣品檢測(cè)合格后，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建.首先用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，隨后將富集到的mRNA隨機(jī)打斷成200 bp左右的短片段.以短片段mRNA為模板，用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成一鏈cDNA，合成雙鏈cDNA時(shí)，dNTPs中的dTTP被dUTP代替.再用核酸純化磁珠純化雙鏈cDNA，然后進(jìn)行末端修復(fù)，并加A尾和測(cè)序接頭.最后用USER酶消化雙鏈cDNA，使其文庫(kù)只含一鏈cDNA，PCR擴(kuò)增15個(gè)循環(huán)得到最終的cDNA文庫(kù).

1.2.4 測(cè)序、數(shù)據(jù)處理 采用Illumina測(cè)序平臺(tái)的雙端測(cè)序模式對(duì)樣本進(jìn)行高通量測(cè)序.根據(jù)Illumina測(cè)序數(shù)據(jù)的低質(zhì)量分?jǐn)?shù)集中于末端的分布特點(diǎn)，運(yùn)用Trim Galore軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)從3′端動(dòng)態(tài)去除并接頭序列片段和低質(zhì)量片段, 再用FastQC軟件對(duì)預(yù)處理數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制分析以及統(tǒng)計(jì)Q20和Q30的堿基比例；然后將修剪后的序列讀數(shù)片段進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，并統(tǒng)計(jì)序列讀數(shù)片段的長(zhǎng)度分布和GC百分比；最后利用STAR軟件將預(yù)處理序列與測(cè)序物種的參考基因組序列(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-93/fasta/sus_scrofa/dna/)進(jìn)行序列比對(duì).

1.2.5 差異表達(dá)基因分析 采用每百萬(wàn)條片段中能匹配到某基因1 000 bp長(zhǎng)的外顯子區(qū)域的片段數(shù)目(FPKM)計(jì)算度量指標(biāo)計(jì)算給藥組和對(duì)照組樣本的基因表達(dá)量，再用DESeq2軟件對(duì)兩組樣本比較篩選差異表達(dá)基因，以|log2差異倍數(shù)|≥1、錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率≤0.05為篩選條件找出顯著差異表達(dá)的基因，并對(duì)其做基因本體論(gene ontology, GO)功能富集分析、京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)注釋及通路富集分析.

1.2.6 熒光定量PCR驗(yàn)證 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)5對(duì)引物(表1)，引物有含黃素單氧化酶2(flavin containing monooxygenase 2,FMO2)、金屬硫蛋白-3(Metallothionein-3,MT3)、溶質(zhì)載體家族2成員13(solute carrier family 2 member 13,SLC2A13)、醛氧化酶1(aldehyde oxidase,AOX1)、溶質(zhì)載體家族35成員5(solute carrier family 35 member A5,SLC35A5)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH).提取給藥組和對(duì)照組的總RNA，經(jīng)完整性檢驗(yàn)合格之后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行熒光定量PCR檢驗(yàn).每個(gè)樣品設(shè)置3組重復(fù)，采用2ΔΔCt法計(jì)算相關(guān)基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平[11].

表1 熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

對(duì)照組和給藥組共6組樣本測(cè)序后得到的原始序列讀數(shù)片段平均為51 343 311條，修剪后的序列讀數(shù)片段平均達(dá)到50 394 236條.其中，每個(gè)樣本中過濾后的Q20堿基比率在97%以上，Q30堿基比率在92%以上，唯一比對(duì)上參考基因的序列讀數(shù)片段數(shù)超過40 442 834條(表2)，說明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控良好，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果真實(shí)可靠.

表2 原始質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.2 基因表達(dá)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果

FPKM為基因表達(dá)量.將對(duì)照組和給藥組差異表達(dá)基因的FPKM進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果如表3所示.在腎臟組織中，高表達(dá)的基因數(shù)(FPKM>50)基本在400左右，而不表達(dá)或者是低表達(dá)的基因數(shù)(FPKM<1)在8 200以上.

表3 全部樣本不同F(xiàn)PKM區(qū)間分布的基因數(shù)1)

2.3 差異基因表達(dá)結(jié)果

針對(duì)有重復(fù)樣本的試驗(yàn)設(shè)計(jì)利用DESeq2軟件在不同樣本組之間篩選差異表達(dá)的已知基因，滿足|log2差異倍數(shù)|≥1、錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率≤0.05的篩選條件篩選兩組之間的差異基因.篩選結(jié)果顯示，一共有301個(gè)差異表達(dá)顯著基因，其中有180個(gè)基因下調(diào)，121個(gè)基因上調(diào).對(duì)差異表達(dá)顯著的基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)其中與代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因表達(dá)量顯著降低，如SLC35A5、SLC2A13、FMO2、AOX1等(表4).

表4 與代謝或轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)量的變化(部分)

2.4 差異表達(dá)基因GO功能富集結(jié)果

利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因分為生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組分3個(gè)方面進(jìn)行注釋.結(jié)果(圖1)顯示：生物學(xué)過程主要富集在對(duì)病毒的防御反應(yīng)、對(duì)外部生物刺激的反應(yīng)、氧氣代謝過程、病毒過程的負(fù)調(diào)節(jié)、病毒生命周期的負(fù)調(diào)節(jié)等；分子功能主要富集在過渡金屬離子結(jié)合、無(wú)機(jī)陰離子交換活性等；細(xì)胞組分主要富集在膜固有成分、膜部分、神經(jīng)元細(xì)胞體、膜的組成部分等.

圖1 差異表達(dá)基因GO功能富集結(jié)果

2.5 差異表達(dá)基因KEGG功能富集結(jié)果

圖2顯示，差異表達(dá)基因顯著富集的通路主要為以下7條：屬于免疫系統(tǒng)的RIG-I-like受體信號(hào)通路和IL-17信號(hào)通路，屬于內(nèi)分泌系統(tǒng)的松弛素信號(hào)通路，屬于感染性疾病的麻疹和甲型流感，屬于輔因子和維生素代謝的視黃醇代謝，屬于物質(zhì)依賴的酒精中毒.

圖2 差異表達(dá)基因KEGG通路富集結(jié)果

給藥組和對(duì)照組差異表達(dá)基因經(jīng)GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，與腎臟代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因FMO2、SLC2A13、AOX1、SLC35A5表達(dá)量均下調(diào)，或許是鉤吻影響腎臟的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和藥物代謝，繼而采用熒光定量PCR驗(yàn)證這些差異表達(dá)基因.結(jié)果(圖3)顯示，基因表達(dá)水平的趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析得到的結(jié)果(表5)基本一致.

***表示P=0.000 1.

表5 5個(gè)與腎臟代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

3 討論

有研究報(bào)道，CYP3A是鉤吻生物堿的主要代謝酶，介導(dǎo)了鉤吻生物堿在體內(nèi)的多種代謝途徑[11].體外研究結(jié)果表明，鉤吻生物堿可以抑制CYP450多個(gè)亞型的活性[12].在本研究中，與代謝相關(guān)的基因，如FMO2、AOX1的表達(dá)量也顯著下調(diào).這兩個(gè)基因都富集在藥物代謝—細(xì)胞色素P450通路上，F(xiàn)MO2是通過以NADP+、FAD為輔酶和輔基實(shí)現(xiàn)異種物質(zhì)代謝，在含氮和含硫的內(nèi)源性底物的代謝過程中扮演著重要角色，可促進(jìn)底物氧化，加快底物代謝[13].AOX1則能催化多種藥物和內(nèi)源性化合物的氧化[14]，與細(xì)胞代謝過程、前體代謝物及能量的產(chǎn)生、代謝等相關(guān).與體外研究結(jié)果[12]一致的是，本研究結(jié)果也表明長(zhǎng)期飼喂鉤吻或許抑制腎臟代謝酶的活性.

藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體是一種膜蛋白，主要負(fù)責(zé)機(jī)體內(nèi)藥物的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和排泄等過程.大量研究表明，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)量的下降[15]會(huì)影響藥物的吸收，從而減弱藥物的治療效果，并且當(dāng)轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性被抑制時(shí)，藥物的攝取和代謝也將會(huì)受到影響，這也是許多藥物之間產(chǎn)生相互作用的重要原因之一[16].本研究結(jié)果表明，與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的基因，如SLC2A13、SLC35A5的表達(dá)量顯著下調(diào).SLC2A13屬于溶質(zhì)載體家族2(SLC2A)，功能主要與轉(zhuǎn)運(yùn)體活性或者轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性有關(guān).另外，SLC2A13基因編碼一種H+/肌醇共轉(zhuǎn)運(yùn)體HMIT，在肌醇的代謝中起到關(guān)鍵作用[17].SLC35A5屬于溶質(zhì)載體家族35，相關(guān)研究較少，目前看來，SLC35A5蛋白或是一種高爾基體多蛋白復(fù)合物，參與核苷酸糖轉(zhuǎn)運(yùn)[18].腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)量的下降，影響了內(nèi)源性物質(zhì)的吸收，糖類等物質(zhì)攝取減少，同時(shí)可能會(huì)對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生影響，松弛素信號(hào)通路被激活；另一方面，轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)減少，物質(zhì)運(yùn)輸受到抑制，減少藥物的排泄，可能會(huì)導(dǎo)致毒性.

本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究鉤吻對(duì)豬腎臟代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)的影響.通過對(duì)基因GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，與代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因出現(xiàn)顯著下調(diào)，如SLC25A5、SLC2A13、FMO2、AOX1等，由此推測(cè)飼喂鉤吻對(duì)仔豬腎臟的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和藥物代謝有一定的影響.