王 玲, 葉冬梅, 包文泉, 白玉娥, 吳曉萌, 孫昊田

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

云杉屬(Picea)是僅次于松屬(PinusLinn)和冷杉屬[Abiesfabri(Mast.)Craib]的隸屬于松科(Pinaceae Spreng)的第三大屬[1]，該屬是裸子植物中較大的一個屬[2]，廣泛分布于北半球[3].目前被世界普遍認可的云杉屬約有34個種(亞洲23個、北美洲8個、歐洲3個)、3個雜交種、3個亞種和15個變種[4].白杄(PiceameyeriRehd.et Wils)(又名毛枝云杉)是我國的特有樹種，分布較廣，主要分布于山西(五臺山區(qū)、管涔山區(qū)、關(guān)帝山)、河北(小五臺山區(qū)、霧靈山區(qū))和內(nèi)蒙古西烏珠穆沁旗[5]，其海拔分布是由南向北呈遞減分布[6].白杄所處的環(huán)境與地理位置的不同，也表現(xiàn)為群體對環(huán)境的適應(yīng)能力和群體內(nèi)部的穩(wěn)定性不同，因此對白杄群體進行遺傳多樣性研究，可以探究白杄群體對環(huán)境的適應(yīng)能力和種內(nèi)變異程度，對我國云杉屬及林木育種研究具有重要的理論和實踐意義.

遺傳多樣性的本質(zhì)是DNA的多態(tài)性[7]，廣義的遺傳多樣性是指地球上所有生物所攜帶的遺傳信息的總和，但通常情況下所說的遺傳多樣性指的是種群內(nèi)的遺傳多樣性，即種群內(nèi)不同個體的遺傳變異總和，故也稱其為基因多樣性[8,9]，分子標記是研究遺傳多樣性的方法之一.對云杉屬多個物種采用常規(guī)染色進行染色體組和核型分析已有50多年[10-15]，最主要的分子標記有RFLP、SSR、RAPD、AFLP、ISSR和DNA序列標記等，研究的云杉屬樹種約有20種，以歐洲云杉(Piceaabies)樹種居多[16-25].王改妮等[26]對云杉復(fù)合體中的白杄(Piceameyeri)、云杉(Piceaasperata)、紅皮云杉(Piceakoraiensis)和西伯利亞云杉(Piceaobovata)的34個居群(332個個體)進行了DNA提取，分別擴增了13個核基因片段，結(jié)果表明4個云杉屬物種擁有共同祖先，其中西伯利亞云杉最先分化，其次是白杄、云杉和紅皮云杉，但后三個物種的分化程度卻不高.Li et al[27]通過mtDNA、nrDNA、cpDNA測序，研究川西云杉(Picealikiangensis)自然種群遺傳分化，結(jié)果表明，川西云杉具有較高的生態(tài)位分化.2013年構(gòu)建了約20 GB的歐洲云杉基因組草圖[28,29]，可通過分析全基因組DNA序列變異為云杉屬群體遺傳學(xué)的深入研究提供可靠的背景，同時提供嶄新的視角和豐富的信息.但是在眾多研究中，白杄群體間的遺傳多樣性和基因分化未見報道.

葉綠體DNA(chloroplast DNA, cpDNA)存在于高等植物葉綠體基質(zhì)中，多以閉合環(huán)狀雙鏈分子存在[30]，且cpDNA為單親遺傳，細胞分裂時不發(fā)生重組[31]，其進化速率僅為核基因進化速率的1/2[32].此外，cpDNA的非編碼區(qū)進化速率更快，能夠提供更多遺傳學(xué)信息，常用于種下與種間植物信息系統(tǒng)重建[30].cpDNA還具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、進化保守及多拷貝等優(yōu)點[33]，可以在短時間內(nèi)構(gòu)建植物cpDNA限制圖譜和只依靠cpDNA即可構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean,UPGMA).近幾年，cpDNA被廣泛應(yīng)用于各個研究領(lǐng)域如分子進化和系統(tǒng)發(fā)育等[30-31，34-35].因此，基于cpDNA分子標記分析白杄群體間遺傳多樣性，探究白杄群體間的遺傳結(jié)構(gòu)、分化、親緣關(guān)系和種內(nèi)變異程度，對于白杄種質(zhì)資源的保護與利用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

研究材料取自山西省(龐泉溝、大石洞、五臺山)、河北省(小五臺山、霧靈山、機械林場)和內(nèi)蒙古自治區(qū)(多倫、正藍旗、九峰山)的9個天然群體，大多數(shù)群體分布于氣溫較低且潮濕的森林地帶，有少數(shù)幾個群體分布于氣溫較低但較為干燥的平原地帶(表1).

表1 9個采樣地的詳細信息

每個群體選擇30個生長正常的單株用GPS進行定位，單株之間的距離至少大于100 m.將無病蟲害的白杄嫩葉迅速裝入密封袋中，放入冰盒，于-80 ℃超低溫冰箱保存待用.

1.2 DNA提取及純度檢測

經(jīng)過DNA預(yù)試驗，最終確定選用試劑盒(Hipure SF plant DNA mini kit)法提取DNA.采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取到的DNA純度.選擇條帶明亮且不拖尾的DNA樣品于-20℃冰箱用于后續(xù)PCR擴增.試驗共檢測了9個群體227個個體.

1.3 cpDNA引物篩選及產(chǎn)物測序

通過NCBI查找獲得9對葉綠體基因片段的信息，合成普通引物，對樣品進行PCR擴增，篩選獲得最適引物.最終從9個葉綠體通用引物中篩選出3個(matk、trnS-trnG和ndhK-C)進行試驗(表2).試驗采用的PCR擴增體系：反應(yīng)的總體積為25 μL，模板DNA 2 μL，正反引物各1 μL，2xTaq Plus Master Mix 25 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL.反應(yīng)體系的條件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 40 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min 30 s，72 ℃ 10 min，4 ℃結(jié)尾，38個循環(huán).取PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格的PCR產(chǎn)物送往上海生工公司進行測序.

表2 引物詳細信息

1.4 數(shù)據(jù)分析

將測序正常的序列通過NCBI進行BLAST比對，確定所獲得的序列是否為目的序列.然后用MEGA 7.0軟件對目的序列進行比對.使用POPGEN軟件分析觀測等位基因數(shù)Na、有效等位基因數(shù)Ne、Nei′s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon′s信息指數(shù)(I)、多態(tài)位點數(shù)(S)、多態(tài)位點百分比(parallel programming library, PPL)、總體遺傳多樣性Ht、群體內(nèi)遺傳多樣性Hs、基因分化系數(shù)Gst和基因流Nm等參數(shù)，根據(jù)Nei′s遺傳距離繪制聚類圖.使用DNAsp軟件對多態(tài)位點數(shù)(S)、平均核苷酸差異(K)、核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)、單倍型個數(shù)(A)和單倍型多樣性(Hd)進行分析.此外，利用APLEQUIN VERSION 3.5軟件分析群體的分子方差變異(AMOVA)，統(tǒng)計群體內(nèi)及群體間的變異方差分布和居群間遺傳分化系數(shù)(Fst).

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取及PCR擴增

使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量(圖1)，DNA長度均>2000 bp，1、2、4、5、6號泳道的DNA濃度約1 000 ng·μL-1，3號泳道的DNA濃度約800 ng·μL-1，提取到的DNA可用于PCR擴增反應(yīng).

M：Marker;1～6：不同個體的DNA.

4、7、8、16號泳道的PCR擴增產(chǎn)物條帶較弱，不可用于后續(xù)的測序，其他產(chǎn)物條帶清晰，濃度高，與目的條帶一致(圖2).

M：Marker;1～18指PCR擴增產(chǎn)物.

2.2 遺傳多樣性

白杄群體個體的檢測結(jié)果表明(表3)，每個位點檢測到的等位基因平均值(Na)、有效等位基因平均值(Ne)、Nei′s基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon′s信息指數(shù)(I)均值分別為2.470 6，1.091 5，0.065 0和0.133 2.基于群體水平，上述指標除Ne外均有降低，分別降低47.4%、6.3%、22.0%，而Ne增加了5.5%.9個群體檢測的Na為1.117 6～1.882 4，表現(xiàn)為DL>JFS=PQG>JXLC=ZLQ>DSD=XWTS=WLS>WTS.Ne是反映群體遺傳變異程度的重要指標，其數(shù)值越接近所檢測到的等位基因的絕對數(shù)，表明等位基因在群體中分布越均勻；Ne為1.034 4～1.779 7，表現(xiàn)為DL>PQG>JXLC>JFS>WLS>ZLQ>DSD>WTS>XWTS，所以DL群體的等位基因在群體中的分布較均勻.各群體的H為0.028 2～0.144 8，表現(xiàn)為DL>PQG>JXLC>JFS>ZLQ>WLS>DSD>WTS>XWTS.I反映位點遺傳多樣性程度，I為0.051 9～0.264 4之間，表現(xiàn)為DL>PQG>JFS>JXLC>ZLQ>WLS>DSD>WTS>XWTS；DL群體的多態(tài)位點數(shù)(S)與多態(tài)位點百分率(PPL)最大，為15個和88.24%，WTS群體的S和PPL最小，為2個和11.76%.

表3 基于cpDNA分子標記各群體遺傳多樣性1)

綜上分析可知，DL群體的遺傳多樣性指標值最高，所以DL群體的遺傳多樣性較高，且具有較好的適應(yīng)能力與進化潛力，而XWTS群體的遺傳多樣性指標值最低，故XWTS的遺傳多樣性較低，對環(huán)境的適應(yīng)能力與進化潛力相對減弱.

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化參數(shù)

基于cpDNA分子標記，白杄群體總遺傳多樣度(Ht)0.065 9，群體內(nèi)遺傳多樣性(Hs)0.060 9，基因分化系數(shù)(Gst)0.074 9，基因流(Nm)6.172 6，可得出結(jié)論：白杄群體間基因分化程度較低且存在廣泛的基因交流.通過對群體間分化水平研究白杄群體的遺傳結(jié)構(gòu)，白杄群體間的分化程度Fst為1.033%，即總遺傳變異的1.033%來自于群體間的遺傳變異，98.97%來自于群體內(nèi)的遺傳變異(表4).

表4 基于cpDNA分子標記的白杄群體方差分析

2.4 各群體單倍型分析

3個葉綠體基因片段(matk、trnS-trnG和ndhK-C)共有61個多態(tài)性位點，表現(xiàn)為：ndhK-C>matk>trnS-trnG；平均核苷酸差異(K)：ndhK-C>trnS-trnG>matk；共產(chǎn)生124個單倍型，表現(xiàn)為：ndhK-C>trnS-trnG>matk.所以ndhK-C片段的多態(tài)性最豐富(表5).

表5 葉綠體基因單倍型多樣性、核苷酸多樣性和核苷酸平均差異1)

群體多態(tài)位點數(shù)(S)12～51個，表現(xiàn)為：DL>WLS>DSD>WTS>JFS=JXLC>PQG=ZLQ>XWTS；群體平均核苷酸差異(K)5.110～11.487，表現(xiàn)為：DL>WLS>DSD>XWTS>WTS>JFS>ZLQ>JXLC>PQG；核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)0.003 36～0.007 55，表現(xiàn)為：DL>WLS>DSD>XWTS>WTS>JFS>ZLQ>JXLC>PQG；單倍型個數(shù)(A)12～18個，表現(xiàn)為：JXLC>DSD=JFS=PQG=ZLQ>WLS>XWTS>DL=WTS；單倍型多樣性(Hd)0.987～1.000，表現(xiàn)為：DSD=WTS=PQG=JXLC=WLS=XWTS>ZLQ>JFS>DL(表6).

表6 白杄9個群體的葉綠體基因單倍型多樣性、核苷酸多樣性和核苷酸平均差異1)

綜上，DL群體的多態(tài)位點數(shù)(S)最大，所以DL群體對環(huán)境變化的適應(yīng)能力更強，更穩(wěn)定，不易受環(huán)境的影響，JXLC群體單倍型個數(shù)(A)和單倍型多樣性(Hd)最大，故JXLC群體較其他群體來說遺傳多樣性較高.

2.5 群體間的遺傳距離與聚類分析

參照Nei′s(1972)分析計算9個群體的親緣關(guān)系.當Nei′s遺傳距離(D)為0，遺傳一致度(I)為1時，兩個群體完全一樣，相反則無任何親緣關(guān)系.群體的I為0.942 3～0.999 2，其平均值為0.992 8，說明群體間存在一定的遺傳變異；D為0.000 8～0.016 0，其平均值為0.005 7，說明群體間相似程度較高.JXLC群體與XWTS群體的D最大(D=0.016 0)，說明兩群體遺傳相似性水平較低，遺傳分化程度較小.DSD群體與ZLQ群體的D最小(D=0.000 8)，說明兩群體的遺傳相似性水平較高(表7).

表7 9個群體間的Nei′s(1972)遺傳距離(****下)與遺傳一致度(****上)1)

利用白杄群體的遺傳距離進行UPGMA聚類分析(圖3).結(jié)果表明，DSD群體與ZLQ群體的遺傳距離最小，可忽略不計，故DSD群體與ZLQ群體的遺傳多樣性相差較小可視為同一群體，與WLS群體的關(guān)系也較為密切.JXLC群體與XWTS群體的遺傳距離最大.在0.365 24～0.397 88任意取值時，分為3類，河北的JXLC群體自成一類，內(nèi)蒙古的JFS群體和山西的XWTS群體聚為一類，其他6個群體聚為一類.由此可知，白杄群體的遺傳多樣性程度較高.

DL：多倫；DSD：大石洞;WTS：五臺山;JFS：九峰山;PQG：龐泉溝;JXLC：機械林場;WLS：霧靈山;WTS：小五臺山;ZLQ：正藍旗.

3 討論與結(jié)論

有研究表明[2]，云杉線粒體基因序列變異水平較低，不適合用于云杉屬的物種界定研究.本試驗選取了4套線粒體(mtDNA)基因片段用以PCR擴增測序，結(jié)果也表明，各片段之間無特異性位點.本試驗還利用cpDNA分子標記對白杄群體遺傳多樣性進行研究.結(jié)果表明，葉綠體DNA序列在云杉屬中擁有更豐富的變異.基因流(Nm)為6.1726，而鄭舒文[36]采用18對ISSR引物研究云杉遺傳多樣性，結(jié)果表明，Nm為2.8441.本試驗基因流程度較高的原因可能由于采樣地較多及采樣點不同的原因.本試驗結(jié)果還得出，白杄群體遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.074 9，F(xiàn)st為1.033%，表明白杄群體的分化能力較弱，但與前人的研究結(jié)果不同(白杄群體的Gst為0.078，F(xiàn)st為0.05～0.15，白杄群體間遺傳分化能力表現(xiàn)為中等)[37]，造成試驗結(jié)果不同的原因可能是所選取基因組片段結(jié)構(gòu)不同，從而得到兩種不同的白杄群體分化結(jié)果.

主要研究結(jié)果：(1)各群體遺傳多樣性指標存在差異.ZLQ群體的遺傳多樣性較高，具有較好的適應(yīng)能力與進化潛力；XWTS群體的遺傳多樣性較低，對環(huán)境的適應(yīng)能力與進化潛力相對減弱；(2)在葉綠體基因水平上共有61個多態(tài)位點(S)，共有124個單倍型(A)，單倍型多樣性(Hd)為0.997 2；片段ndhK-C的多態(tài)性最好；(3)白杄群體間基因分化程度不大(Gst=0.074 9)，存在廣泛的基因交流(Nm=6.172 6)；總遺傳變異的1.033%來自于群體間的遺傳變異，98.97%來自于群體內(nèi)的遺傳變異；(4)通過遺傳距離的UPGMA聚類分析，將9個群體分為3類群，即河北的機械林場(JXLC)自為一類，內(nèi)蒙古的九峰山(JFS)與山西的小五臺山(XWTS)聚為一類，其他6個群體聚為一類，所以白杄群體的遺傳多樣性程度較高.