高 陽, 杜 鑫, 李冰綃, 高亞銳, 張慧男, 張瀚林, 禹世欣, 柏 卉

(白城師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，吉林 白城 137000)

角鯊烯是一種天然的多不飽和三萜，廣泛存在于動(dòng)物肝臟和植物籽實(shí)中.1916年，日本學(xué)者在鯊魚肝臟中提取出角鯊烯[1].最初，角鯊烯多用于緩解干燥和濕疹引起的皮膚損傷，因其具有高效的單態(tài)氧清除能力[2].隨后，大量研究表明，角鯊烯在調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、心血管保護(hù)等方面也發(fā)揮著重要作用[3]；體內(nèi)試驗(yàn)證明了角鯊烯的安全性和飼用可行性[4].Dhandapani et al[5]研究表明，角鯊烯在緩解異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心臟氧化應(yīng)激中發(fā)揮著重要作用.Zhang et al[6]研究表明，角鯊烯對種公豬精液品質(zhì)具有較好的改善作用.Gabás-Rivera et al[7]研究表明，補(bǔ)飼角鯊烯可增加小鼠血清中高密度脂蛋白和對氧磷酶-1的水平，并緩解小鼠的氧化應(yīng)激損傷.Chen et al[8]研究指出，角鯊烯能夠改善Ross雞胸肌肉品質(zhì).

然而，角鯊烯作為畜禽飼料添加劑的研究依舊不多，尤其是對早期斷奶仔豬腸道健康方面的研究.眾所周知，早期斷奶加劇仔豬應(yīng)激，從母乳到飼料的改變使尚未發(fā)育健全的仔豬腸道面臨巨大挑戰(zhàn).因此，有效緩解仔豬早期斷奶應(yīng)激，維持仔豬腸道機(jī)能與健康，為豬場創(chuàng)造效益具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義.因此，本研究利用角鯊烯作為飼料添加劑，探究其對早期斷奶仔豬空腸形態(tài)、黏膜通透性和抗氧化能力的影響，旨在為角鯊烯在豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供實(shí)踐依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

角鯊烯購自宜春大海龜生命科學(xué)有限公司，純度約為92%.抗氧指標(biāo)化試劑盒購自南京建成生物工程研究所.RNA提取、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本東洋紡公司.腸道緊密連接蛋白抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗體購自ABCAM公司.其余試劑均購自長春華益生物有限公司.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取24頭21日齡早期斷奶的三元雜交(杜洛克豬×長白豬×大白豬)仔豬，均為去勢雄性.將仔豬隨機(jī)分為2組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2頭.A組飼喂基礎(chǔ)日糧，B組飼喂基礎(chǔ)日糧+250 mg·kg-1角鯊烯.預(yù)飼期3 d，正飼期21 d，所有仔豬自由飲水和采食.飼養(yǎng)試驗(yàn)于2020年9月在吉林省四平市梨樹市四棵樹鄉(xiāng)養(yǎng)殖合作社進(jìn)行.

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所有仔豬前腔靜脈采血后進(jìn)行麻醉并處死.打開仔豬腹腔收集空腸樣本.將前腔靜脈血靜止2 h，于3 500 r·min-1、4 ℃條件下離心5 min分離血清，血清分裝于凍存管中，干冰預(yù)冷后轉(zhuǎn)至120 ℃凍存.使用尼龍線扎緊空腸并剪取空腸樣本，使用生理鹽水沖洗空腸組織，收集3份空腸樣本，每份長度為1～1.5 cm，分別保存于多聚甲醛、PBS緩沖液和液氮中，用于后續(xù)檢測.

1.3 試驗(yàn)飼糧的配制

基礎(chǔ)日糧參考文獻(xiàn)[9-10]的方法配制，日糧組成和營養(yǎng)水平如表1所示.

表1 基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.4 指標(biāo)測定

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)步驟參照試劑盒的說明書進(jìn)行操作.HE染色切片處理與分析參照沈夢城[11]的方法.尤斯—灌流試驗(yàn)中熒光素異硫氰酸酯—葡聚糖4 kDa(fluorescein isothiocyanate-dextran 4 kDa, FD4)通透性和跨膜電阻測定參照Yin[12]的方法.實(shí)時(shí)熒光定量PCR中mRNA提取、反轉(zhuǎn)及緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin mRNA相對表達(dá)量的測定參照Zhao et al[13]和Che et al[14]的方法.采用Primer Premier 6.0軟件進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如表2所示.

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0軟件中的One-Way ANOVA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Duncun′s多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 角鯊烯對早期斷奶仔豬空腸形態(tài)的影響

由表3可知，與A組相比，B組仔豬空腸絨毛高度及絨毛高度與隱窩深度的比值顯著提高(P<0.05)，隱窩深度顯著下降(P<0.05).A和B組仔豬空腸腸道形態(tài)如圖1所示.

表3 角鯊烯對早期斷奶仔豬空腸形態(tài)的影響

圖1 早期斷奶仔豬空腸形態(tài)(100×)

2.2 角鯊烯對早期斷奶仔豬空腸黏膜通透性及損傷標(biāo)識物水平的影響

由表4和表5可知，與A組相比，B組仔豬血清和空腸組織中的二胺氧化酶活性、D-乳酸濃度和再生胰島衍生蛋白3含量顯著下降(P<0.05)，血清中的髓過氧化物酶含量顯著下降(P<0.05).在空腸黏膜通透性方面，與A組相比，B組仔豬空腸黏膜FD4通透性顯著下降(P<0.05)，跨膜電阻顯著提高(P<0.05).

表4 角鯊烯對早期斷奶仔豬血清中黏膜損傷標(biāo)識物水平的影響

2.3 角鯊烯對早期斷奶仔豬空腸緊密連接蛋白表達(dá)量的影響

由表6可知，與A組相比，B組仔豬空腸組織中ZO-1、Occludin和Claudin基因mRNA的相對表達(dá)量均顯著提高(P<0.05).由表7可知，在蛋白水平上，B組仔豬空腸組織中ZO-1、Occludin和Claudin蛋白的相對表達(dá)量均顯著高于A組(P<0.05).

表6 角鯊烯對早期斷奶仔豬空腸緊密連接蛋白基因mRNA表達(dá)量的影響

表7 角鯊烯對早期斷奶仔豬空腸緊密連接蛋白相對表達(dá)量的影響

2.4 角鯊烯對早期斷奶仔豬空腸抗氧化水平的影響

由表8可知，與A組相比，B組仔豬空腸組織中的丙二醛濃度顯著下降(P<0.05)，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶的活性顯著提高(P<0.05).

表8 角鯊烯對早期斷奶仔豬空腸抗氧化水平的影響

3 討論

一般情況下，仔豬斷奶日齡多為28～35 d，早期斷奶日齡為21 d.早期斷奶能夠提高母豬的周轉(zhuǎn)率和產(chǎn)房的利用率，降低哺乳期仔豬的生產(chǎn)成本，有利于生物安全防控[15-17].然而，早期斷奶仔豬的消化道發(fā)育尚不健全，難以發(fā)揮其消化和免疫功能，進(jìn)而影響仔豬的生產(chǎn)性能和生長潛力[15-16,18].研究表明，仔豬斷奶引起的腸道氧化損傷會加速腸道上皮細(xì)胞凋亡，損傷腸道的結(jié)構(gòu)與功能[19].因此，改善早期斷奶仔豬的腸道健康水平，緩解斷奶應(yīng)激對仔豬的生長具有十分積極的意義.研究表明，角鯊烯能夠在調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和心血管保護(hù)等方面發(fā)揮重要作用[8,20].本研究結(jié)果表明，在飼糧中添加角鯊烯能顯著提高早期斷奶仔豬空腸絨毛高度及絨毛高度與隱窩深度的比值，并顯著降低隱窩深度.原因可能是，角鯊烯獨(dú)特的全反式6雙鍵結(jié)構(gòu)賦予其極佳的流動(dòng)性，能迅速分布在受損的腸道上，發(fā)揮其抗炎和抗氧化作用，為腸道絨毛的發(fā)育提供有利條件.仔豬空腸絨毛高度及絨毛高度與隱窩深度比值的提高，有利于空腸發(fā)揮消化和免疫功能，保證仔豬的生長與健康.

腸道的通透性是評價(jià)腸道完整性的重要指標(biāo).研究表明，仔豬在應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體自由基水平升高[15]，自由基能捕捉并進(jìn)攻腸黏膜細(xì)胞的脂類結(jié)構(gòu)，造成脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞通透性增大和腸道損傷[21-22].本研究結(jié)果顯示，在飼糧中添加角鯊烯能顯著降低早期斷奶仔豬血清和空腸組織中腸道損傷標(biāo)識物的水平，表明角鯊烯在清除機(jī)體自由基方面能夠發(fā)揮重要作用，維護(hù)了仔豬空腸的結(jié)構(gòu)與功能.本研究中，在飼糧添加角鯊烯，仔豬空腸黏膜FD4通透性下降，跨膜電阻提高，血清中的腸道損傷標(biāo)識物水平下降，說明角鯊烯能顯著改善早期斷奶仔豬空腸黏膜的通透性，在保護(hù)空腸方面發(fā)揮重要作用.本研究結(jié)果還表明，角鯊烯能顯著提高早期斷奶仔豬空腸緊密連接蛋白的表達(dá)水平，這一結(jié)果與空腸形態(tài)、空腸黏膜通透性的結(jié)果相符.腸道中緊密連接蛋白的表達(dá)量與腸道的健康水平密切相關(guān)，完整的腸道細(xì)胞排列不僅有助于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，還能發(fā)揮重要的屏障功能，有利于緩解斷奶應(yīng)激并增強(qiáng)仔豬的抗逆性.

斷奶后，仔豬的營養(yǎng)源從母乳轉(zhuǎn)變?yōu)轱暳?，飼料中的粗纖維雖能刺激腸道發(fā)育，但更易造成空腸絨毛損傷[23-24].仔豬空腸組織中的丙二醛濃度能反映氧化損傷程度.研究表明，肉雞和大鼠補(bǔ)飼角鯊烯能顯著降低血清、肝臟和肌肉組織中的丙二醛濃度，并提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶等抗氧化酶的活性[8,25-26].其原因可能有兩個(gè)方面：一方面，角鯊烯通過調(diào)控機(jī)體多種抗氧化酶活性，實(shí)現(xiàn)機(jī)體自由基的清除；另一方面，角鯊烯可通過維持三羧酸循環(huán)酶和呼吸標(biāo)記酶的活性，以此改善能量狀態(tài)并增強(qiáng)線粒體的抗氧化力[26-28].

4 結(jié)論

在飼糧中添加250 mg·kg-1角鯊烯可顯著改善早期斷奶仔豬的空腸形態(tài)，有效保護(hù)空腸黏膜通透性并提高空腸組織的抗氧化功能.因此，可初步判斷角鯊烯在緩解早期斷奶仔豬應(yīng)激和維持腸道健康方面具有積極作用.