楊兆輝, 汪子洋, 楊文濤, 蔡瑜婷, 譚偉龍, 黃恩炯, 張靈玲

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.東部戰(zhàn)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南京 210002；3.福州國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心，福建 福州 350001)

蛋白質(zhì)乙酰化是一種重要的翻譯后修飾方式，廣泛發(fā)生于細(xì)胞內(nèi)各種生化反應(yīng)進(jìn)程中，與許多生物功能相關(guān).真核生物中有80%～90%的蛋白質(zhì)發(fā)生了乙?；揎?，原核生物中也廣泛存在該種修飾方式.例如：Chunaram et al[1]發(fā)現(xiàn),乙?；嬖谟诩?xì)胞各處，參與細(xì)胞增殖、mRNA剪切、蛋白質(zhì)合成等過(guò)程；人體代謝酶也發(fā)生了許多乙?；揎?，基因調(diào)控、糖代謝、TCA循環(huán)、尿素循環(huán)、脂肪酸循環(huán)等生化進(jìn)程均受到乙?；{(diào)控，以適應(yīng)不同的環(huán)境狀態(tài)[2-3]；Kumar et al[4]發(fā)現(xiàn),在利什曼原蟲(chóng)(Leishmaniaspp.)中組蛋白發(fā)生乙?；揎棔?huì)影響細(xì)胞的活力.HAT3是一種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，能介導(dǎo)增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)發(fā)生乙?；揎棧鳳CNA在DNA復(fù)制及受損修復(fù)進(jìn)程中起著重要的作用.當(dāng)HAT3被清除時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯下降，且經(jīng)相同紫外光照射處理后細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于有HAT3基因的菌株，說(shuō)明乙?；饔玫膯适?huì)影響細(xì)胞的穩(wěn)定性和修復(fù)能力.

乙?；D(zhuǎn)移酶可催化乙酰輔酶A(AcCoA)上的乙酰基向蛋白質(zhì)N-末端丙氨酸殘基的α-氨基上轉(zhuǎn)移，從而讓蛋白質(zhì)在翻譯過(guò)程中或翻譯結(jié)束后發(fā)生可逆或不可逆的修飾[5-6].Liew et al[7]發(fā)現(xiàn)，核糖體蛋白乙?；潭鹊慕档蜁?huì)抑制蛋白質(zhì)的合成，且核糖體蛋白乙?；瘯?huì)在起始復(fù)合物形成時(shí)發(fā)生；Vetting et al[8]發(fā)現(xiàn),核糖體蛋白S5的乙?；揎椏梢栽谝欢ǔ潭壬弦种坪颂求w蛋白S4的基因突變；李淑嫻[9]發(fā)現(xiàn),幾乎所有的核糖體蛋白都具有乙?；揎棧凳竞颂求w蛋白對(duì)乙?；揎椌哂衅眯裕乙阴；揎棔?huì)調(diào)控核糖體的合成，影響核糖體的組裝.

蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis, Bt)是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，可通過(guò)編碼殺蟲(chóng)晶體蛋白對(duì)多種昆蟲(chóng)起毒殺作用，是目前研究最深入、應(yīng)用最廣泛的微生物殺蟲(chóng)劑[10].然而，當(dāng)前有關(guān)Bt蛋白乙?；揎椀膱?bào)道較少.本課題組在前期研究中獲得了一株高效殺蚊Bt新菌株LLP29[11]，通過(guò)對(duì)該菌株基因組進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)其存在可能編碼一種乙?；D(zhuǎn)移酶的ykkB基因，但該基因在Bt中是否可通過(guò)對(duì)Bt蛋白的乙酰化修飾影響菌株生物學(xué)特性還不得而知.因此，本研究以ykkB基因?yàn)榘袠?biāo)，克隆、表達(dá)該基因，并通過(guò)生物信息學(xué)分析該基因的序列特征，為進(jìn)一步明確ykkB基因在Bt中的功能提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 LLP29菌株總DNA提取

將Bt LLP29甘油菌以1%接種量轉(zhuǎn)接至5 mL LB培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)過(guò)夜，12 000 r·min-1離心2 min分離菌體，使用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒提取Bt LLP29總DNA.

1.2 ykkB基因的克隆

根據(jù)課題組前期研究得到的LLP29菌株基因組信息，添加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)ykkB基因特異性上游引物ykkB-F1(5′-CCATGGCTGATATCGGATCCATGCATACAAAACATGATCGTGAA-3′)和下游引物ykkB-R1(5′-CGACGGAGCTCGAATTCTCATCCAACACGTTTAATGGAATAAAC-3′)，以Bt LLP29總DNA為模板，55 ℃為退火溫度，體外擴(kuò)增ykkB基因，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物.以BamHⅠ和EcoRⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)通過(guò)酶切pET-32a構(gòu)建克隆連接載體，再通過(guò)全式金無(wú)縫克隆試劑盒將線性載體與ykkB基因目的片段連接，然后熱激轉(zhuǎn)化進(jìn)EscherichiacoliTrans1-T1菌株.陽(yáng)性克隆子通過(guò)PCR及單雙酶切驗(yàn)證，并將驗(yàn)證正確的pET-32a-ykkB-T1質(zhì)粒委托福州白鯨生物技術(shù)有限公司測(cè)序.

1.3 ykkB基因生物信息學(xué)分析

利用NCBI中的開(kāi)放閱讀框查找器(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)將ykkB基因序列轉(zhuǎn)化成氨基酸序列后，通過(guò)MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；利用ExPASy中的ProtParam功能(https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)YkkB蛋白序列進(jìn)行氨基酸組分分析；利用ExPASy中的ProtScale功能(https://web.expasy.org/protscale/)對(duì)YkkB蛋白進(jìn)行親水性分析；利用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)YkkB蛋白進(jìn)行跨膜域分析.

1.4 YkkB蛋白的表達(dá)

將1.2中構(gòu)建的pET-32a-ykkB-T1菌株質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coliBL21菌株，陽(yáng)性克隆子通過(guò)PCR及單雙酶切驗(yàn)證，并將驗(yàn)證正確的pET-32a-ykkB-T1-BL21質(zhì)粒委托福州白鯨生物技術(shù)有限公司測(cè)序.參考張跡等[12]的方法，將驗(yàn)證成功的pET-32a-ykkB-T1-BL21置于1‰AmpLB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至D600 nm約為0.6，然后加入50 μL 100 mg·mL-1IPTG，16 ℃誘導(dǎo)20 h.根據(jù)陳凡冰等[13]的方法提取總蛋白，用SDS-PAGE電泳檢測(cè).

1.5 體外自乙?；囼?yàn)

參考孫曼鑾[14]的方法，以乙酰輔酶A作為乙?；w，在離心管中分別加入200 μL 1 mg·mL-1純化后的YkkB蛋白和50 μL 5 mg·mL-1的乙酰輔酶A(對(duì)照組添加200 μL純化后的YkkB蛋白和50 μL 50 mmol·L-1Tris-HCl)，將樣品混合均勻，37 ℃反應(yīng)3 h.反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)SDS-PAGE分離樣品，并使用泛乙酰化抗體為一抗，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠為二抗，通過(guò)Western Blot檢測(cè)YkkB蛋白的乙?；揎棾潭?

2 結(jié)果與分析

2.1 ykkB基因的克隆

根據(jù)ykkB基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，以Bt菌株 LLP29總DNA為模板PCR擴(kuò)增目的基因，通過(guò)電泳檢測(cè)，獲得一條大小約為600 bp的目的條帶(圖1A)，與預(yù)期一致，說(shuō)明成功獲得ykkB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物.

將ykkB基因PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于E.coliTrans1-T1，提取陽(yáng)性克隆子pET-32a-ykkB-T1質(zhì)粒DNA，通過(guò)PCR驗(yàn)證，同樣獲得一條大小約為600 bp的條帶(圖1B)；用限制性?xún)?nèi)切酶QuickCutBamHⅠ對(duì)陽(yáng)性克隆子質(zhì)粒進(jìn)行單酶切驗(yàn)證，獲得一條大小約為6 500 bp(載體與目的基因之和)的條帶(圖1C泳道2)；用BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，分別獲得大小約為5 900和600 bp的條帶(圖1C泳道3).將提取成功的pET-32a-ykkB-T1質(zhì)粒委托福州白鯨生物技術(shù)有限公司，以pET-32a通用引物T7 Terminator單項(xiàng)測(cè)通，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI的BLAST進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)測(cè)序序列與目的序列同源性高達(dá)100%.以上結(jié)果說(shuō)明ykkB基因已成功克隆.

A.ykkB基因的PCR擴(kuò)增(M:200 bp DNA ladder;泳道1:陰性對(duì)照；泳道2:ykkB基因)；B.pET-32a-ykkB-T1質(zhì)粒的PCR驗(yàn)證(M:200 bp DNA ladder;泳道1:ykkB基因)；C.pET-32a-ykkB-T1質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證(M:DL15 000 DNA ladder;泳道1:pET-32a-ykkB-T1-BL21質(zhì)粒;泳道2:pET-32a-ykkB-T1質(zhì)粒單酶切;泳道3:pET-32a-ykkB-T1質(zhì)粒雙酶切).

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1ykkB基因家族的同源進(jìn)化分析 利用NCBI中的開(kāi)放閱讀框查找器將ykkB基因序列轉(zhuǎn)化成氨基酸序列，再用NCBI中的Blast對(duì)Bt LLP29菌株中YkkB蛋白進(jìn)行同源性比對(duì)，并選取不同菌株中的同源序列用MEGA 7.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，設(shè)置1 000 bootstrap引導(dǎo)程序值檢驗(yàn)進(jìn)化樹(shù).結(jié)果顯示，Bt LLP29-ykkB與WP 141526681.1:1-187 MULTISPECIES: GNAT family N-acetyltransferaseBacilluscereusgroup和WP 003263049.1:1-187 MULTISPECIES: GNAT family N-acetyltransferaseBacillus菌株的距離最近(圖2)，表明Bt菌株中ykkB基因與這兩個(gè)基因的親緣關(guān)系較近，可能是一類(lèi)N-乙酰轉(zhuǎn)移酶.

圖2 Bt菌株LLP29中ykkB同源進(jìn)化分析

2.2.2 YkkB蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè) 利用ExPASy中的ProtParam對(duì)Bt中YkkB蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，YkkB蛋白的分子質(zhì)量約為21.58 ku.氨基酸組成分析表明：YkkB蛋白中含量最多的是賴(lài)氨酸(Lys)和亮氨酸(Leu)，均有18個(gè)，占比9.63%；含量最少的是半胱氨酸(Cys)，有1個(gè)，占比0.53%；酸性氨基酸數(shù)量為19個(gè)，占比10.16%；堿性氨基酸數(shù)量為34個(gè)，占比18.18%；親水性氨基酸數(shù)量為44個(gè)，占比23.53%；疏水性氨基酸數(shù)量為90個(gè)，占比48.13%；負(fù)電殘基(Asp+Glu)的總數(shù)為19個(gè)；正電殘基(Arg+Lys)的總數(shù)為28個(gè)(表1).通過(guò)等電點(diǎn)分析，預(yù)測(cè)YkkB蛋白的等電點(diǎn)為9.52；分子式為C982H1535N265O269S7，總原子數(shù)為3 058 mol；不穩(wěn)定指數(shù)為28.28，是一種穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)為86.58；平均吸水性(GRAVY)為-0.384.

表1 Bt菌株LLP29中YkkB蛋白氨基酸組成分析

2.2.3 氨基酸疏水性、跨膜區(qū)預(yù)測(cè) 通過(guò)ExPASy中的ProtScale并使用Kyte & Doolittle算法對(duì)Bt中YkkB蛋白進(jìn)行親水性分析，發(fā)現(xiàn)其最大值為2.067，最小值為-2.822(圖3)，即YkkB為一種親水性蛋白質(zhì)；利用TMHMM Server v.2.0在線工具對(duì)YkkB蛋白進(jìn)行跨膜域分析，發(fā)現(xiàn)YkkB蛋白無(wú)跨膜區(qū)，約有56%的可能性在膜外(圖4).

圖3 Bt菌株LLP29中YkkB的親水性分析

圖4 Bt菌株LLP29中YkkB的跨膜區(qū)分析

2.3 YkkB蛋白的表達(dá)、純化

構(gòu)建ykkB基因表達(dá)載體并將該基因轉(zhuǎn)化至E.coliBL21，將成功轉(zhuǎn)化的pET-32a-ykkB-T1-BL21和僅轉(zhuǎn)化了空載體的pET-32a-BL21擴(kuò)大培養(yǎng)至D600 nm為0.6時(shí)加入IPTG，16 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h，經(jīng)鎳柱親和層析純化后將其通過(guò)SDS-PAGE驗(yàn)證，獲得一條大小約為39 ku的條帶(圖5).這與預(yù)期一致，說(shuō)明YkkB蛋白表達(dá)成功.

M:蛋白預(yù)染Marker;泳道1:YkkB蛋白;泳道2:pET-32a空載.

2.4 體外自乙酰化試驗(yàn)結(jié)果

以乙酰輔酶A為乙?；w，將表達(dá)純化后的YkkB蛋白與乙酰輔酶A體外結(jié)合，并通過(guò)Western Blot檢測(cè)YkkB蛋白的乙?；揎椙闆r.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，YkkB蛋白與乙酰輔酶A體外結(jié)合后蛋白乙?；揎棾潭燃訌?qiáng)(圖6).由此可見(jiàn)，YkkB蛋白可接受乙?；w提供的乙酰基，其可作為一類(lèi)乙?；D(zhuǎn)移酶發(fā)揮作用.

3 小結(jié)

乙?；悄壳把芯枯^多的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾途徑，其是在乙?；D(zhuǎn)移酶的催化下通過(guò)轉(zhuǎn)移乙?；w讓蛋白質(zhì)在翻譯過(guò)程中或翻譯結(jié)束后發(fā)生修飾，從而改變蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性或使生物快速響應(yīng)并適應(yīng)不斷變化的環(huán)境[15].Ramagopal et al[16]發(fā)現(xiàn),穩(wěn)定期E.coli核糖體蛋白L12的N端乙?；潭缺葘?duì)數(shù)生長(zhǎng)期高，說(shuō)明乙?；揎椩谛迯?fù)老化細(xì)胞方面有一定作用.然而，Bt賴(lài)氨酸2，3-氨基變位酶kamR調(diào)控的基因可能與孢子形成有重要關(guān)聯(lián)[17].

本課題組前期對(duì)Bt LLP29菌株的基因組進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)該菌株編碼ykkB基因.通過(guò)基因注釋發(fā)現(xiàn)其可能是一個(gè)編碼乙?；D(zhuǎn)移酶的基因.為了解BtykkB基因的功能，本研究通過(guò)克隆技術(shù)成功將其克隆至E.coliTrans1-T1.通過(guò)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)該蛋白賴(lài)氨酸和亮氨酸含量最高，說(shuō)明作為乙酰基直接作用的氨基酸位點(diǎn)，YkkB多樣的賴(lài)氨酸和亮氨酸位點(diǎn)可對(duì)乙酰基結(jié)合及蛋白的乙?；揎棸l(fā)揮重要作用.通過(guò)基因同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，ykkB基因存在于多種生物體內(nèi)，包括枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)、熱帶芽孢桿菌(B.tropicus)等.其中，Bt LLP29-ykkB與WP 141526681.1:1-187 MULTISPECIES: GNAT family N-acetyltransferaseBacilluscereusgroup和WP 003263049.1:1-187 MULTISPECIES: GNAT family N-acetyltransferaseBacillus的親緣關(guān)系最近.通過(guò)理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，YkkB蛋白是一種穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)，無(wú)跨膜區(qū)，且有較大概率存在于膜外，說(shuō)明水溶性的YkkB蛋白可為更多的蛋白乙?；揎椞峁┛赡?本研究還成功表達(dá)、純化了YkkB蛋白，將其與乙酰輔酶A體外結(jié)合并通過(guò)Western Blot分析發(fā)現(xiàn)，YkkB蛋白的乙?；揎棾潭扔兴訌?qiáng)，說(shuō)明該蛋白有接受乙?；哪芰?，可以通過(guò)向底物提供乙?；l(fā)揮乙?；D(zhuǎn)移酶作用.但是，YkkB具體如何在Bt菌株中通過(guò)乙?；绊懫渖砩磻?yīng)，還需進(jìn)一步探討.