王東姣, 張 暢, 闕蓓蓓, 尤垂淮, 羅 俊, 蘇亞春

(1.福建農(nóng)林大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部福建甘蔗生物學與遺傳育種重點實驗室；2.福建農(nóng)林大學教育部作物遺傳育種與綜合利用重點實驗室；3.福建農(nóng)林大學國際學院；4.福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建 福州 350002)

植物在生長發(fā)育過程中受到逆境脅迫時會在植物體內(nèi)形成復雜的防御調(diào)控網(wǎng)絡，轉(zhuǎn)錄因子在此期間起著重要的調(diào)節(jié)作用[1].WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為植物轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子中最大的家族之一，在植物抗逆性方面具有重要功能[2].由60個氨基酸組成的WRKY結(jié)構(gòu)域是WRKY轉(zhuǎn)錄因子典型的結(jié)構(gòu)域[3].在某些WRKY蛋白中，WRKY結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列已被WRRY、WKRY、WSKY、WVKY或WKKY替換[4].WRKY結(jié)構(gòu)域的特征是在N端具有一個高度保守的核心WRKYGQK基序和位于C端的由CX4-5CX22-23HX1H或CX7CX7-23HX1C組成的鋅指結(jié)構(gòu)[5].根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和類型，WRKY轉(zhuǎn)錄因子可分為3類[6].第Ⅰ類：WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有2個WRKY域.第Ⅱ或第Ⅲ類：WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有1個WRKY域.第Ⅰ、Ⅱ類的WRKY成員所具有的鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2(CX4-5CX22-23HX1H)，其中X可以是任何氨基酸.第Ⅲ類的WRKY蛋白所含的鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC(CX7CX23HXC)[5].根據(jù)各成員之間的同源性，第Ⅱ類WRKY家族又可以分為Ⅱa～Ⅱe等5個亞類[7].Dong et al[8]則將擬南芥(Arabidopsisthaliana)WRKY家族的第Ⅱ類分為Ⅱa～Ⅱg等7個亞類.

首個甘薯(Ipomoeabatatas)WRKY轉(zhuǎn)錄因子被克隆后[9]，在其他100多個植物物種中相繼鑒定出WRKY基因家族.Guo et al[10]在葡萄(Vitisvinifera)中鑒定到59個VvWRKY基因，其在不同組織中的表達模式有所不同，且55個VvWRKY基因?qū)χ辽僖环N非生物脅迫處理有不同程度的響應，38個VvWRKY基因在白粉病(Erysiphenecator)感染后差異表達.Chanwala et al[11]在珍珠粟(Pennisetumamericarum)中共鑒定出97個PgWRKY蛋白，并將其分為三大類(Ⅰ～Ⅲ)，PgWRKY基因家族成員分布在7條染色體上，其基因啟動子區(qū)存在多種順式調(diào)控元件.由此可見，WRKY轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物的生長發(fā)育和逆境應答過程.甘蔗(Saccharumspp.)是重要的糖料作物和能源作物[12].甘蔗近緣野生種割手密(Saccharumspontaneum)為現(xiàn)代栽培雜交種提供了病蟲害和逆境相關的抗性基因，約占了甘蔗雜交種基因組的15%，其四倍體基因組被組裝到了32條染色體上[13].Li et al[13]在割手密基因組中鑒定到154個SsWRKY基因家族成員，RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)SsWRKY在46個不同發(fā)育階段的樣品中顯示出不同的時間和空間表達模式，其中，52個SsWRKY基因在所有組織中表達，4個SsWRKY基因未在任何組織中表達，21個SsWRKY基因可能參與光合作用.甘蔗栽培種(Saccharumspp.hybrid)R570擁有迄今為止較為完整的甘蔗栽培種基因組信息，該品種具有廣泛的適應性，在世界多個育種站被用作親本，同時在留尼旺、毛里求斯和瓜德羅普島商業(yè)化種植[14].R570基因組約為115條染色體，其中,10%染色體來自割手密，10%染色體來自割手密與熱帶種(Saccharumspontaneum)的重組染色體，其余來自于熱帶種染色體[14].目前，在甘蔗上已有關于WRKY基因的研究報道(Sc-WRKY[15]、ScWRKY3[16]、ScWRKY4[17]、ScWRKY5[18]和ScWRKY6[19])，但有關甘蔗栽培種WRKY基因家族的鑒定尚未見報道.

甘蔗黑穗病是由甘蔗鞭黑粉菌(Sporisoriumscitamineum)引起的一種真菌病害，隨著宿根年限的延長危害逐年加重，制約了甘蔗產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[20].本研究基于甘蔗栽培種R570基因組[14]挖掘和鑒定了甘蔗ShWRKY家族轉(zhuǎn)錄因子，分析了其染色體分布、系統(tǒng)發(fā)育、理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、基因上游啟動子順式作用元件以及在不同甘蔗組織和黑穗病菌脅迫下的基因表達模式，并利用實時熒光定量PCR(real time quantitative PCR, RT-qPCR)技術(shù)檢測了候選ShWRKY基因在不同甘蔗基因型與黑穗病菌互作下的表達水平，旨在了解甘蔗栽培種WRKY基因家族成員的序列特征和表達特性，為進一步的WRKY基因克隆及其抗病功能解析提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 甘蔗栽培種ShWRKY基因家族的鑒定

甘蔗栽培種R570的基因組數(shù)據(jù)從Sugarcane Genome Hub(https://sugarcane-genome.cirad.fr/)[14]下載.通過在線網(wǎng)站Pfam數(shù)據(jù)庫[21]下載隱馬爾科夫模型(hidden markov model, HMM)WRKY DBD(PF03106)的HMM模型[22]，用來識別R570基因組序列中的WRKY序列.去重復后，利用Conserved Domain Database[23]網(wǎng)站查看WRKY的假定保守結(jié)構(gòu)域，進行WRKY保守結(jié)構(gòu)域的鑒定、篩選.

1.2 ShWRKY基因家族的染色體定位分析

從R570基因組數(shù)據(jù)庫[14]中下載序列GFF3文件，獲得WRKY基因長度信息以及位置信息，然后使用MapGene2Chrom(MG2C)軟件對ShWRKY基因染色體定位實現(xiàn)可視化，染色體顏色設置為綠色，其余參數(shù)為默認參數(shù).

1.3 ShWRKY蛋白的系統(tǒng)進化分析

用MUSCLE v3.7[24]進行蛋白序列比對，采用PhyloSuite[25]軟件中的IQ-TREE構(gòu)建ShWRKY蛋白與水稻(Oryzasativa)OsWRKY蛋白[26]的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，設置重復值為1 000次.借助EvolView[27]在線網(wǎng)站對進化樹進行美化.

1.4 ShWRKY蛋白的多序列比對、理化性質(zhì)和亞細胞定位分析

通過DNAMAN軟件進行ShWRKY蛋白的多序列比對.采用ExPASy的ProtParam[28]進行ShWRKY蛋白理化性質(zhì)預測，包括編碼氨基酸個數(shù)、分子量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)和平均疏水性.利用Euk-mPLoc 2.0.[29]在線網(wǎng)站預測ShWRKY蛋白的亞細胞定位.

1.5 ShWRKY基因家族的保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

通過MEME在線網(wǎng)站[30]分析獲得ShWRKY基因家族的保守基序信息，參數(shù)設置顯示10個保守基序，其余為默認參數(shù).ShWRKY基因家族的外顯子—內(nèi)含子結(jié)構(gòu)信息從甘蔗栽培種R570基因組GFF3文件中獲取.使用TBtools[31]軟件實現(xiàn)ShWRKY的保守基序和基因結(jié)構(gòu)的可視化.

1.6 ShWRKY基因家族啟動子順式作用元件的查找與功能預測

基于甘蔗栽培種R570基因組數(shù)據(jù)庫[14]，調(diào)取ShWRKY基因家族啟動子前2 000 bp序列.利用PlantCARE在線網(wǎng)站[32]對ShWRKY基因家族上游啟動子順式作用元件進行功能預測，并用TBtools[31]軟件對其進行可視化.

1.7 ShWRKY基因家族在不同甘蔗組織和黑穗病菌脅迫下的表達模式分析

分別基于構(gòu)建的甘蔗主要栽培種ROC22成熟期的不同組織(蔗皮、蔗肉、根、葉和芽)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫以及甘蔗黑穗病感病品種ROC22和甘蔗黑穗病抗病品種YC05-179接種黑穗病菌后不同時間(0、1、2和5 d)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[20]，調(diào)取WRKY轉(zhuǎn)錄本信息，并與鑒定到的R570數(shù)據(jù)庫中的ShWRKY基因家族進行序列比對，選取序列相似度在90%以上的ShWRKY基因進行組織表達模式分析和黑穗病菌脅迫下的表達模式分析.ShWRKY基因的轉(zhuǎn)錄豐度以FPKM(fragements per kilobase of transcript per million mapped)值作為分析指標，并利用TBtools[31]軟件繪制熱圖.

1.8 實時熒光定量(RT-qPCR)分析

甘蔗品種包括2個抗黑穗病甘蔗品種(YT96-86和YZ03-258)和2個感黑穗病甘蔗品種(YZ03-103和FN40)，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部福建甘蔗生物學與遺傳育種重點實驗室提供.選取10個月齡的健康且長勢一致的甘蔗莖段，在32 ℃催芽培養(yǎng)，當芽萌發(fā)至1～2 cm后，處理組用5×106個·mL-1(含0.01%吐溫-20)的黑穗病菌混合孢子懸浮液針刺接種蔗芽；對照組接種無菌水[20].然后，將處理組和對照組置28 ℃、16 h(光照)/8 h(黑暗)培養(yǎng).分別于接種0、1、3和7 d后收集5個單芽，液氮凍存后，-80 ℃冰箱儲存.

利用Trizol法提取樣品RNA，按照PrimeScript RT Reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒說明書合成第一鏈cDNA，以10倍稀釋液作為RT-qPCR模板.利用primer5軟件設計兩個候選ShWRKY基因ShWRKY37和ShWRKY51的特異性定量引物ShWRKY37-Q-F/R(5′-GTGAAGAGGACCATCAGAGTGCC-3′和5′-TGTAGTAGCCCCGTGGGTAAGG-3′)和ShWRKY51-Q-F/R(5′-CGGCTACAAGTGGAGGAAGT-3′和5′-TGTGGTGTTCTTGGTGGATAG-3′).內(nèi)參基因為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因(GeneBank登錄號為CA254672)，引物為GAPDH-Q-F/R(5′-CACGGCCACTGGAAGCA-3′和5′-TCCTCAGGGTTCCTGATGCC-3′).利用ABI 7500 Real-time PCR System(美國)進行RT-qPCR檢測，按照SYBR Green PCR Master Mix Kit 說明書進行RT-qPCR擴增程序和反應體系配置，用2-ΔΔCt方法計算定量數(shù)據(jù)[33].

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗栽培種ShWRKY基因家族的鑒定

在甘蔗栽培種R570基因組數(shù)據(jù)庫中篩選具有完整結(jié)構(gòu)域的WRKY序列，最終獲得60條ShWRKY基因，根據(jù)其在染色體上的位置，依次命名為ShWRKY1～ShWRKY60(表1).

表1 基于甘蔗栽培種R570基因組數(shù)據(jù)庫鑒定獲得的60條ShWRKY基因信息

2.2 ShWRKY基因家族的染色體定位

染色體定位結(jié)果顯示，ShWRKY基因家族成員一共定位在10條R570染色體上，每條染色體分布3～13個ShWRKY基因(圖1).3號染色體分布的ShWRKY基因數(shù)目最多，為13個.4號、6號和7號染色體分布的ShWRKY基因數(shù)目最少，均只有3個.其次，9號染色體分布9個ShWRKY基因，2號染色體分布8個ShWRKY基因，1號和8號染色體均分布6個ShWRKY基因，10號染色體分布5個ShWRKY基因，5號染色體分布4個ShWRKY基因.其中分布在2號染色體上的ShWRKY基因出現(xiàn)成簇聚集現(xiàn)象，即ShWRKY7～ShWRKY11基因聚集分布.從染色體定位情況來看，ShWRKY基因家族與其它物種的基因家族類似，存在基因成簇聚集，推測它們可能具有相似的功能.

染色體的數(shù)目顯示在每條染色體的頂部.左邊的比列尺代表染色體長度(Mb).

2.3 ShWRKY蛋白的系統(tǒng)進化分析

以水稻OsWRKY基因序列為參考，構(gòu)建ShWRKY基因家族的系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖2)，結(jié)果顯示ShWRKs共分為三大類(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)，第Ⅱ類又分為5個亞類(Ⅱa～Ⅱe).屬于第Ⅰ類WRKY家族成員的有10個，第Ⅱ類有32個(Ⅱa類2個、Ⅱb類5個、Ⅱc類15個、Ⅱd類5個、Ⅱe類5個)，第Ⅲ類有18個.總的來說，ShWRKY基因家族中屬于Ⅱ類和Ⅲ類的家族成員較多，屬于Ⅰ類的家族成員相對較少.

ShWRKY：甘蔗栽培種R570 WRKY.OsWRKY：水稻W(wǎng)RKY.

2.4 ShWRKY蛋白的多序列比對、理化性質(zhì)和亞細胞定位分析

ShWRKY蛋白多序列比對結(jié)果(圖3)顯示，Ⅰ類家族成員位于N末端的WRKY結(jié)構(gòu)域均未發(fā)生變異，為WRKYGQK；Ⅱ類家族成員中Ⅱa、Ⅱb、Ⅱd、Ⅱe亞類的WRKY結(jié)構(gòu)域均未發(fā)生變異，Ⅱc亞類中的ShWRKY4、ShWRKY17、ShWRKY47和ShWRKY51位于N末端的WRKY結(jié)構(gòu)域發(fā)生變異，表現(xiàn)為WKKYGQK和WRKYGKK；Ⅲ類中的ShWRKY25、ShWRKY31、ShWRKY32、ShWRKY34和ShWRKY44的WRKY結(jié)構(gòu)域均發(fā)生變異，表現(xiàn)為WKKYGQK和WRKYGEK，其位于C末端的鋅指結(jié)構(gòu)也與Ⅰ類和Ⅱ類家族成員有所不同，為CX7CX7-23HX1C，而Ⅰ類和Ⅱ類家族成員為CX7CX7-23HX1H.蛋白理化性質(zhì)和亞細胞定位預測結(jié)果顯示，60個ShWRKY序列編碼氨基酸的個數(shù)為139～721，分子質(zhì)量為15 163.74～76 738.43 u，等電點在7.0以下的有32個.除ShWRKY13蛋白為穩(wěn)定的親水性核定位蛋白，推測其余ShWRKY家族成員均為不穩(wěn)定的親水性核定位蛋白.

WRKY結(jié)構(gòu)域WRKYGQK、WRKYGKK或者WKKYGQ用紅色框線標注；鋅指結(jié)構(gòu)(CX4-5CX22-23HX1H和CX7CX7-23HX1C)用黑色框線標注；星號標注主要的結(jié)構(gòu)域序列.

2.5 ShWRKY基因家族的保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果(圖4)顯示，ShWRKY基因家族成員含有1～5個外顯子，其中4個ShWRKY有1個外顯子，15個ShWRKY有2個外顯子，31個ShWRKY有3個外顯子，6個ShWRKY有4個外顯子，4個ShWRKY有5個外顯子.進一步分析發(fā)現(xiàn)，屬于同一分類的ShWRKY基因具有相似的外顯子數(shù)目，如4個屬于Ⅱe類的ShWRKY家族成員都有3個外顯子.同時也存在屬于同一類的ShWRKY家族成員含有的外顯子數(shù)目不同，如屬于Ⅰ類的ShWRKY家族成員含有的外顯子數(shù)目為1～5個不等.該結(jié)果為ShWRKY基因家族成員的功能分化提供依據(jù).

A：ShWRKY蛋白系統(tǒng)發(fā)育進化樹；B：ShWRKY基因的內(nèi)含子—外顯子結(jié)構(gòu)；C：ShWRKY蛋白保守基序分布.

利用MEME軟件分析60個ShWRKY蛋白的保守基序，共查找了ShWRKY蛋白的10個保守基序.圖4顯示，ShWRKY基因家族的保守基序有3～7個，且屬于家族同一類型的ShWRKY蛋白具有相似的保守基序.大多數(shù)ShWRKY家族成員都有Motif 1、Motif 2和Motif 3，其中Motif 1含有WRKYGQK序列.有一些保守基序為某個WRKY類別所特有，如只屬于Ⅰ類ShWRKY家族成員的Motif 4，而Motif 8為Ⅱd類ShWRKY家族成員所特有，Motif 5、Motif 9和Motif 10為Ⅲ類ShWRKY家族成員所特有.結(jié)果表明保守基序在家族同一類型的ShWRKY中存在相似性，而在不同類型ShWRKY中存在多樣性，推測特有的Motif可能在不同類型ShWRKY家族成員中發(fā)揮特定作用.

2.6 ShWRKY基因家族啟動子順式作用元件的功能分析

對ShWRKY基因家族上游前2 000 bp的啟動子順式作用元件功能進行預測，結(jié)果顯示，多個順式作用元件與脅迫、生長發(fā)育和激素響應相關(圖5).其中，與脅迫相關的順式作用元件包括干旱誘導元件(MBS)，低溫響應元件(LTR)，干旱、低溫、鹽脅迫響應元件(DRE)和機械損傷響應元件(WUN-motif).生長發(fā)育相關元件包括厭氧誘導元件(ARE)、分生組織表達元件(CAT-box)、參與玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控元件(O2-site)、種子特異性調(diào)控元件(RY-element)和參與胚乳表達的順式調(diào)控元件(GCN4-motif).激素響應元件包括茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)響應元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)、生長素(auxin, IAA)響應元件(AuxRR-core和TGA-element)、脫落酸(abscisic acid, ABA)響應元件(ABRE)、赤霉素(gibberellin, GA)響應元件(GARE-motif和P-box)和水楊酸(salicylic acid, SA)響應元件(TCA-element).其中只有屬于Ⅱd類的ShWRKY3和Ⅱc類的ShWRKY17包含參與干旱、低溫、鹽脅迫的響應元件DRE，屬于Ⅲ類的ShWRKY31包含14個MeJA響應元件CGTCA-motif，屬于Ⅱc類的ShWRKY53和ShWRKY54包含15個ABA響應元件ABRE.由此推測ShWRKY基因家族可能參與甘蔗生長發(fā)育和逆境應答進程.

A.ShWRKY蛋白系統(tǒng)發(fā)育進化樹；B.ShWRKY基因啟動子順式作用元件分布；C.ShWRKY基因啟動子順式作用元件數(shù)目.不同顏色的盒子代表不同的順式作用元件.

2.7 ShWRKY基因家族在不同甘蔗組織和黑穗病菌脅迫下的表達模式

通過比對甘蔗ROC22成熟期的組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和同源性發(fā)現(xiàn)ShWRKY基因的表達存在組織特異性，且屬于同一類型的ShWRKY基因在甘蔗不同組織中的表達模式存在差異(圖6).其中，38個ShWRKY基因在5個甘蔗組織(蔗皮、蔗肉、根、葉和芽)中均有表達(log2FPKM>0)，2個ShWRKY基因(ShWRKY42和ShWRKY43)在5個甘蔗組織中均不表達.屬于Ⅰ類的ShWRKY48、Ⅱc類的ShWRKY51、Ⅱd類的ShWRKY37、Ⅲ類的ShWRKY9和ShWRKY26在甘蔗5個組織中均高表達(log2FPKM>15)，26個ShWRKY基因在甘蔗組織中均低表達(log2FPKM<10).而Ⅱc類的ShWRKY22、Ⅱe類的ShWRKY23和Ⅱd類的ShWRKY37在芽中的表達量明顯高于其它組織.

表達水平的變化從藍色(低表達)到紅色(高表達).SE：蔗皮；SP：蔗肉；R：根；L：葉；B：芽.

甘蔗受黑穗病菌侵染的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[20]分析結(jié)果(圖7)顯示，除ShWRKY34基因外，其余ShWRKYs基因均受黑穗病菌誘導表達，超過一半的ShWRKY基因(72%)在甘蔗黑穗病感病品種ROC22和抗病品種YC05-179中低表達(log2FPKM<10)，4個ShWRKY基因(ShWRKY23、ShWRKY37、ShWRKY48和ShWRKY51)在ROC22和YC05-179中高表達(log2FPKM>15).相比于0 d，隨著接種黑穗病菌時間的延長(1～5 d)，Ⅰ類的ShWRKY12和ShWRKY48、Ⅱd類的ShWRKYs、Ⅱc類的ShWRKY51/53/54在兩品種中總體呈上調(diào)表達趨勢，Ⅱe類的ShWRKY23在感病品種中上調(diào)表達而在抗病品種中下調(diào)表達，其余ShWRKYs基因的表達豐度相對較低.

表達水平的變化從藍色(低表達)到紅色(高表達)，如圖右上圖的顏色梯度所示.基于log2 FPKM變化數(shù)據(jù)采用TBtools軟件對黑穗病菌脅迫的響應進行了熱圖分析和分層聚類.ROC22-0 d、ROC22-1 d、ROC22-2 d和ROC22-5 d分別代表甘蔗感黑穗病病品種ROC22接種黑穗病菌0 d、1 d、2 d和5 d；YC05-179-0 d、YC05-179-1 d、YC05-179-2 d和YC05-179-5 d分別代表甘蔗抗黑穗病病品種崖城05-179接種黑穗病菌0 d、1 d、2 d和5 d.

2.8 候選ShWRKY基因在不同甘蔗品種與黑穗病菌互作下的表達

結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，進一步挑選出兩個在蔗芽組織高表達且受黑穗病菌誘導表達的Ⅱd類ShWRKY37和Ⅱc類ShWRKY51基因，利用RT-qPCR分析其在4個甘蔗品種與黑穗病菌互作下的表達情況(圖8).結(jié)果(圖8)顯示，接種黑穗病菌7 d后，ShWRKY37基因在抗黑穗病甘蔗品種YT96-86、YZ03-258和感黑穗病甘蔗品種YZ03-103中的表達量均上調(diào)，分別為對照組的1.89、1.87和1.35倍；而在感黑穗病甘蔗品種FN40中的表達量顯著下調(diào)，為對照組的0.19倍(圖8A).ShWRKY51基因在抗黑穗病甘蔗品種YT96-86和YZ03-258接種黑穗病菌1～7 d后的表達量均呈下降趨勢，而在感黑穗病甘蔗品種YZ03-103和FN40接種早期(1 d)中的表達量顯著上升，分別為對照組的2.25和1.66倍，隨后下調(diào)表達或恢復至對照水平(圖8B).

A：ShWRKY37基因在甘蔗受黑穗病菌脅迫下的表達量.B：ShWRKY51基因在甘蔗受黑穗病菌脅迫下的表達量.YT96-86和YZ03-258：抗黑穗病甘蔗品種(R)；YZ03-103和FN40：感黑穗病甘蔗品種(S).實驗數(shù)據(jù)以GAPDH的表達水平進行歸一化處理.所有的數(shù)據(jù)點表示平均值±標準誤(n=3).柱上不同的字母代表由新復極差法計算的顯著性差異(P<0.05).

3 討論

植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子是一個大家族，關于WRKY基因家族的全基因組分析已在許多物種中廣泛開展，如割手密[13]、油橄欖(Oleaeuropaea)[34]、菠蘿[35]和二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)[36]等.本研究首次對甘蔗栽培種R570基因組中的ShWRKY基因家族進行挖掘，共鑒定出分布于10條染色體上的60個家族成員ShWRKY1～ShWRKY60(表1)，且在2號染色體上出現(xiàn)了基因簇(ShWRKY7～ShWRKY11)(圖1).在水稻中，OsWRKY基因家族成員同樣在染色體上成簇聚集[37].前人研究表明，基因聚集代表這些基因可能具有相似的結(jié)構(gòu)和功能[38].以OsWRKY家族成員分類為參考，將ShWRKYs分為三大類(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)，屬于Ⅱ類(32個)和Ⅲ類(18個)的較多，屬于Ⅰ類(10個)的相對較少(圖2).作為WRKY的進化祖先，Ⅰ類WRKY成員的功能不像Ⅱ類或Ⅲ類WRKY成員那樣多樣化[7].Ⅱ類WRKY在擬南芥中可通過調(diào)節(jié)抗病機制中的關鍵基因或蛋白來調(diào)控植物的抗病性[39].Wang et al[40]報道第Ⅲ類WRKY可以影響植物抗病能力，并在生物進化過程中，當遭受外界脅迫時可以促進植物的適應性[41].在水稻中，部分WRKY蛋白的氨基酸序列發(fā)生變異，突變?yōu)閃RRY、WSKY、WKRY、WVKY或WKKY[42].在本研究中，多重序列比對顯示ShWRKY家族成員的WRKY結(jié)構(gòu)域有WRKYGQK、WKKYGQK、WRKYGKK和WRKYGEK幾種類型(圖3).值得注意的是，WRKYGQK基序的變異主要出現(xiàn)在ShWRKY家族的Ⅱc亞類和Ⅲ類中，暗示Ⅱc亞類和Ⅲ類的WRKY基因可能具有多種生物學功能.外顯子—內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的多樣化在許多基因家族的進化中起著重要的作用，不同染色體片段的重排和融合導致外顯子—內(nèi)含子的獲得和丟失[10].外顯子和內(nèi)含子之間的結(jié)構(gòu)差異也被認為是系統(tǒng)發(fā)育分組的有用工具，這種多樣性是基因家族進化、多樣化和新功能的重要組成部分[4,43,44].本研究中，屬于同一類別或不同類別的ShWRKY家族成員的外顯子—內(nèi)含子數(shù)目存在差異，推測基因結(jié)構(gòu)的不同會導致ShWRKY家族成員出現(xiàn)功能分化.基序的種類和數(shù)目是WRKY家族分類的重要依據(jù)[42].圖4C顯示，所有的ShWRKY都具有WRKY結(jié)構(gòu)域，說明它們都屬于WRKY家族成員，同一類別的ShWRKY家族成員大都有相似的motif種類和數(shù)目，而不同類別的ShWRKY家族成員所包含的motif種類和數(shù)目有所不同，推測ShWRKY基因可能因motif的種類和個數(shù)不同而具有不同的生物學功能.

WRKY轉(zhuǎn)錄因子本身具有的順式作用元件在植物的脅迫反應中發(fā)揮重要作用[45].前人研究[46]報道，在響應青枯菌(Pseudomonassolanacearum)侵染以及高溫脅迫下，辣椒(Capsicumannuum)CaWRKY40啟動子中的DWE(Double-W box-element)被誘導表達并發(fā)揮作用；同時，DWE驅(qū)動下CaWRKY40的轉(zhuǎn)錄水平受到了CaWRKY40自身以及CaWRKY27和CaWRKY58等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控.經(jīng)MeJA處理后，對長春花(Catharanthusroseus)CrWRKY1啟動子表達量進行分析，發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)域在-230～-93 bp包含一個推定的MeJA響應元件，推測CrWRKY1啟動子有可能被用來分離參與TIA通路調(diào)控的新的轉(zhuǎn)錄因子[47].許多研究[48,49]報道顯示，WRKY對干旱、寒冷和鹽堿等多種脅迫都有反應，這可能是由于上游基因特異性結(jié)合相應的順式元件來調(diào)控WRKY基因的表達.本研究也發(fā)現(xiàn)ShWRKY基因家族上游啟動子具有多個與脅迫、生長發(fā)育和激素響應相關的順式作用元件(圖5)，推測ShWRKY基因家族可能參與甘蔗生長發(fā)育和逆境應答進程.

Huang et al[50]研究發(fā)現(xiàn)10個SlWRKY基因幾乎在番茄所有組織中均組成型表達.在割手密中，SsWRKY在46個不同發(fā)育階段樣本中的表達譜呈現(xiàn)出不同的時空模式，其中52個SsWRKY基因在所有組織中表達，4個SsWRKY基因在所有組織中不表達[13].ShWRKY基因家族成員在甘蔗中的表達同樣具有組織特異性，如38個ShWRKY基因在5個甘蔗組織中均有表達，而2個ShWRKY基因在甘蔗組織中不表達(圖6).WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物先天免疫系統(tǒng)的兩個分支即觸發(fā)免疫(triggered immunity, PTI)和效應觸發(fā)免疫(effector-triggered immunity, ETI)中發(fā)揮重要作用[51].在蘋果(Malusdomestica)中，超過一半(119個中的63個)的MdWRKY基因?qū)Τ嘈遣【?Alternariaalternata)的侵染有響應[52].本研究中，72%的ShWRKY基因在感黑穗病品種ROC22和抗黑穗病品種YC05-179中低表達，4個ShWRKY基因在兩品種中高表達(圖7).Liuet al[15]發(fā)現(xiàn)甘蔗Ⅱc類Sc-WRKY基因在甘蔗品種FN22中能夠被甘蔗黑穗病菌誘導表達.甘蔗Ⅱc類ScWRKY3基因的表達水平在感黑穗病甘蔗雜交種ROC22中下降，在抗黑穗病甘蔗雜交種YC05-179中保持不變[16].前人研究[53]表明，黑穗病菌主要通過蔗芽侵染蔗株.本研究中，ShWRKY22、ShWRKY23和ShWRKY37在芽中的表達量高于其它組織(圖6)，推測這3個基因可能主要在芽中發(fā)揮功能.此外，受黑穗病菌侵染后，Ⅰ類的ShWRKY12和ShWRKY48、Ⅱc類的ShWRKY51/53/54和Ⅱd類的ShWRKYs在甘蔗抗病和感病品種中總體呈上調(diào)表達趨勢，Ⅱe類的ShWRKY23在感病品種中上調(diào)表達而在抗病品種中下調(diào)表達，表明這些基因參與對黑穗病菌脅迫的響應過程.此外，ShWRKY37基因在2個甘蔗抗病品種和1個感病品種中上調(diào)表達，而在另外1個感病品種中下調(diào)表達，ShWRKY51則在抗病品種中下調(diào)表達，在感病品種應答早期(1 d)上調(diào)表達(圖8).從進化樹關系來看，與ShWRKY37同源性較高的OsWRKY68蛋白被報道可能通過下游的PR1b和PR10a在Xa21介導的水稻抵抗白葉枯病的途徑中發(fā)揮作用[54].同樣，ShWRKY37的同源蛋白OsWRKY7啟動子在根和葉中的表達均受水稻白葉枯病菌[Xanthomonasoryzaepv.Oryzae(Xoo)]P10生理小種侵染的誘導，暗示其參與了水稻對白葉枯菌的防御反應[55].由此推測，ShWRKY37和ShWRKY51基因可能直接或間接的參與甘蔗對黑穗病菌的防御反應，兩者有望作為候選基因用于進一步的抗病功能驗證和分子機制解析研究.