熊焱強， 馮 晶， 劉朝奇， 李志英

1三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院婦產(chǎn)科，宜昌 443001 2三峽大學(xué)腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室，宜昌 443002

宮頸癌(cervical cancer)是最常見的婦科惡性腫瘤之一，2018年全球約有57萬新發(fā)病例，31.1萬死亡病例，在女性惡性腫瘤中發(fā)病率排第2位，死亡率排第4位[1]。高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)持續(xù)感染是宮頸癌的主要發(fā)病原因，其中以HPV16、18型與宮頸癌的相關(guān)性最強，而E6和E7是HPV的主要癌基因[2]。研究發(fā)現(xiàn)，HPV可以通過早期表達的調(diào)節(jié)蛋白作用于宿主細胞的miRNA引起宿主細胞增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為改變[3]。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)HPV16 E7可以促進腫瘤細胞增殖，加速細胞周期G1期向S期進展，其機制可能與下調(diào)miR-29a的表達有關(guān)[4]。本文旨在探究HPV16 E7基因通過調(diào)控細胞內(nèi)miR-29a表達促進細胞增殖的分子機制，為進一步研究宮頸癌的發(fā)病機制及新的治療靶點提供初步理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

主要試劑：RPMI 1640培養(yǎng)液(美國Sigma公司)，小牛血清(美國Gibco公司)，Trizol(美國Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Fermentas公司)，PVDF膜、蛋白印跡相關(guān)試劑(美國Amersham公司)，鼠抗人CDK6抗體、鼠抗人β-actin抗體(美國Santa Cruz公司)，羊抗鼠IgG-HRP抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)，雙熒光素酶檢測試劑盒(美國Promega公司)，miR-29a mimic、inhibitor(廣州銳博生物科技公司)。引物及DNA合成、測序均由上海生工生物工程有限公司完成。主要儀器：高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，PCR儀(美國Applied Biosystems公司)，Mini型垂直板電泳系統(tǒng)、硝酸纖維素膜電轉(zhuǎn)系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)，GEL LOGIC凝膠分析系統(tǒng)(美國KODAK公司)，EPICS XL-4流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)，多功能熒光酶標儀(瑞士TECAN公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) PC3細胞株由三峽大學(xué)腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室保存。細胞使用RPMI 1640培養(yǎng)液，同時加入10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建 攜帶HPV16 E7基因的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-E7構(gòu)建方法同前期文獻報道[4]。報告基因質(zhì)粒pGL3-cM-CDK6-CS的構(gòu)建如下：通過TargetScan軟件查找miR-29a種子序列與CDK6 mRNA的3′UTR潛在結(jié)合位點，設(shè)計以下寡脫氧核酸序列：5′-CGCGTCAGAATGCTCTGTTTTGGTGCTTCAGAATGCTCTGTTTTGG-TGCTTCAGAATGCTCTGTTTTGGTGCTTC-3′；5′-TCGAGAAGCACCAAAACAGAGCATTCTG-AAGCACCAAAACAGAGCATTCTGAAGCACC-AAAACAGAGCATTCTGA-3′(下劃線分別為MluⅠ和XhoⅠ粘性末端)，由上海生工合成。將2條DNA單鏈退火后得到雙鏈DNA，命名為“CDK6-CS”，再將CDK6-CS片段克隆到熒光素酶報告基因載體pGL3-cM中。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染 6孔板內(nèi)細胞培養(yǎng)到對數(shù)生長期，密度約70%～80%為轉(zhuǎn)染最佳狀態(tài)。轉(zhuǎn)染前1 h，把培養(yǎng)液更換為不含血清及雙抗的1640培養(yǎng)液。用培養(yǎng)液將純化質(zhì)粒和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000稀釋，室溫靜置20 min后均勻多點加入待轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)液，5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h后更換含10% NBCS的RPMI 1640培養(yǎng)液。研究HPV16 E7功能是通過用HPV16 E7及其載體質(zhì)粒處理PC3細胞來實現(xiàn)的，實驗分2組：pcDNA3.1(-)載體組(PC3-3.1組)和pcDNA3.1(-)-E7組(PC3-E7組)；研究miR-29a的功能通過加入miR-29a mimic及inhibitor完成。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達 收集對數(shù)生長期細胞，提取處理后的細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度后配平，取8 μg總蛋白與5×上樣Buffer混勻后煮沸5 min制樣，再同5 μL marker分別加入泳道，用10%SDS-PAGE分離膠進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，洗滌后加入一抗(鼠抗人CDK6抗體，1∶1000)中室溫孵育2 h后，漂洗3次，加入二抗(羊抗鼠IgG-HRP抗體，1∶3000)中室溫孵育1 h后，TBST漂洗3次，暗室ECL顯影。用凝膠成像系統(tǒng)對X線片中顯出的目的條帶進行灰度分析，β-actin作為內(nèi)參照。

1.2.5 半定量RT-PCR檢測 轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)48 h后用Trizol提取RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以cDNA為模板，加入引物(PCR引物序列見表1)，PCR檢測其表達水平。取PCR產(chǎn)物8 μL在2% Agrose凝膠中電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)對條帶進行灰度分析定量，以β-actin作為內(nèi)參基因。

1.2.6 熒光素酶活性檢測 將報告基因質(zhì)粒pGL3-cM-CDK6-CS分別瞬時轉(zhuǎn)染細胞PC3-3.1和細胞PC3-E7；同時將報告基因質(zhì)粒pGL3-cM-CDK6-CS與miR-29a inhibitors瞬時共轉(zhuǎn)染PC3-3.1細胞，或與miR-29a mimics瞬時共轉(zhuǎn)染PC3-E7細胞。轉(zhuǎn)染36 h后收集細胞，加入裂解液100 μL，4 ℃下充分裂解細胞，然后取20 μL至不透光96孔板，加入100 μL熒光素酶底物混勻后置于多功能酶標儀中檢測熒光強度。通過熒光素酶活性的高低判斷對目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控情況。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布 收集對數(shù)生長期細胞及上清至15 mL試管，2000 r/min室溫離心5 min，棄上清，加1 mL流式固定液重懸細胞，4 ℃固定30 min。加入500 μL流式打孔液重懸細胞并轉(zhuǎn)移至流式管，加0.5 mg/mL PI染料90 μL，室溫避光染色30 min，尼龍膜過濾后上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以“均值±標準差”表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV16 E7對細胞周期相關(guān)基因及miR-29a潛在靶基因的影響

應(yīng)用半定量RT-PCR檢測PC3-3.1和PC3-E7兩種細胞中細胞周期相關(guān)基因CDK4、CyclinE2、E2F1及miR-29a潛在靶基因CDK6及HBP1的表達情況，發(fā)現(xiàn)在PC3-E7中這些基因表達均呈不同程度上調(diào)，與PC3-3.1比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，其中CDK6表達差異最大，見圖1A、1B。Western blot結(jié)果顯示PC3-E7細胞中CDK6蛋白表達明顯高于PC3-3.1細胞(P<0.01)，見圖1C、1D。

A、B：半定量RT-PCR分析各基因mRNA相對表達量；C、D：Western blot分析CDK6蛋白相對表達量；**P<0.01圖1 HPV16 E7對細胞周期相關(guān)基因、miR-29a潛在靶基因及CDK6蛋白表達的影響Fig.1 Effects of HPV16 E7 on cell cycle related genes，miR-29a potential target gene and CDK6 protein expression

2.2 miR-29a直接抑制靶基因CDK6的表達

通過TargetScan軟件查找miR-29a種子序列與CDK6 mRNA的3′UTR潛在結(jié)合位點，見圖2A。熒光素酶實驗進一步驗證發(fā)現(xiàn)：與空白對照組相比，miR-29a mimic共轉(zhuǎn)染HPV16 E7組酶活性較低，而inhibitor共轉(zhuǎn)染組酶活性較高，直接證實了miR-29a可與CDK6 3′UTR結(jié)合并下調(diào)熒光素酶表達；另外PC3-E7細胞熒光素酶活性較PC3-3.1高，見圖2B，提示HPV16 E7可以通過下調(diào)miR-29a從而促進CDK6表達。

將miR-29a mimics、inhibitors分別瞬時轉(zhuǎn)染PC3-E7和PC3-3.1細胞后，Western blot檢測CDK6蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-29a mimic的PC3-E7細胞中CDK6蛋白的表達水平降低(P<0.01，見圖2C、2D)；而轉(zhuǎn)染miR-29a inhibitor的PC3-3.1細胞中CDK6蛋白的表達水平升高(P<0.05，見圖2E、2F)。這進一步證實了HPV16 E7可以通過下調(diào)miR-29a而促進CDK6表達。

A：預(yù)測miR-29a與CDK6 mRNA的3′UTR潛在結(jié)合位點；B：熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果；C、D：PC3-E7細胞轉(zhuǎn)染miR-29a mimic后Western blot分析CDK6蛋白表達；E、F：PC3-3.1細胞轉(zhuǎn)染miR-29a inhibitor后Western blot分析CDK6蛋白表達；*P<0.05，**P<0.01圖2 miR-29a與CDK6的靶向關(guān)系Fig.2 Targting relationship between miR-29a and CDK6

2.3 miR-29a對細胞周期分布的影響

將miR-29a mimic和inhibitor分別轉(zhuǎn)染PC3-E7和PC3-3.1，流式細胞術(shù)分析細胞周期分布情況，結(jié)果如圖3所示：向PC3-3.1轉(zhuǎn)染miR-29a inhibitor，G0/G1期細胞減少，而S、G2/M期細胞增多，說明促進細胞周期從G1向S期進展；向PC3-E7細胞轉(zhuǎn)染miR-29a mimic，G0/G1期細胞增多，而S、G2/M期細胞減少。這提示miR-29a通過下調(diào)CDK6抑制細胞增殖，恢復(fù)PC3-E7細胞中miR-29a表達至少可以部分逆轉(zhuǎn)HPV16 E7的促增殖效應(yīng)。

A：流式細胞術(shù)檢測miR-29a對細胞周期分布的影響；B：PC3-3.1細胞轉(zhuǎn)染miR-29a inhibitor后細胞周期中各時期細胞百分比的變化；C：PC3-E7細胞轉(zhuǎn)染miR-29a mimic后細胞周期中各時期細胞百分比的變化；**P<0.01圖3 miR-29a對細胞周期分布的影響Fig.3 The effect of miR-29a on cell cycle distribution in cells

3 討論

宮頸癌是全球范圍內(nèi)最常見的婦科惡性腫瘤之一，在絕大部分的宮頸癌患者中均存在HPV感染。高危型HPV的持續(xù)感染是其發(fā)病過程中的主要危險因素，其中HPV16和HPV18是最常見的2種致癌亞型。HPV基因組的調(diào)控功能主要由E區(qū)基因編碼，其中E6基因編碼的E6蛋白可以調(diào)節(jié)癌基因p53的表達，發(fā)揮致癌作用，而E7基因編碼的蛋白可以降解Rb，釋放E2F轉(zhuǎn)錄因子，從而影響細胞周期的調(diào)控，誘導(dǎo)細胞惡性增殖[2，5]。miRNAs是一類長度約為18～25 nt的內(nèi)源性非編碼小RNA，在生物體內(nèi)起重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，廣泛參與了細胞的各種生物學(xué)行為，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的調(diào)控作用[6]。眾多研究均提示：高危型HPV的E6、E7等致癌基因可以通過影響miRNAs的表達來調(diào)控相應(yīng)靶基因的表達從而促進宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。Kong等[7]研究發(fā)現(xiàn)HPV E7蛋白過表達后可以上調(diào)miR-21的表達，從而促進HeLa細胞的增殖和侵襲。而抑制E7的表達后HeLa細胞中的miR-21表達下調(diào)，并抑制細胞的增殖和侵襲。Chen等[8]研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌中高危HPV E7通過TGF-β/Smad4信號通路上調(diào)miR-182的表達，其具體機制是高危HPV E7與pRb結(jié)合后，E2F從復(fù)合物中釋放出來并結(jié)合到TGF-β啟動子區(qū)域，導(dǎo)致TGF-β過表達，TGF-β過表達時Smad4信號通路被激活，導(dǎo)致Smad4與miR-182啟動子區(qū)相互作用，進而導(dǎo)致miR-182在宮頸癌細胞及周圍細胞中表達上調(diào)，促進宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)HPV16 E7可以促進細胞增殖，加速細胞周期G1向S期進展，其機制與下調(diào)miR-29a的表達有關(guān)[4]。

miR-29a在包括宮頸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中均呈低表達，被認為是一種抑癌基因，其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Nan等[9]研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織中miR-29a呈低表達，且其表達的下調(diào)與宮頸癌不良預(yù)后密切相關(guān)，進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-29a通過直接靶向SIRT1參與宮頸癌的遷移、侵襲和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程，故可以認為miR-29a/SIRT1軸與宮頸癌的發(fā)病密切相關(guān)。Gong等[10]發(fā)現(xiàn)在宮頸癌中miR-29a能夠直接抑制DNMT1，抑制SOCS1啟動子的甲基化并上調(diào)其表達。此外，miR-29a還可以促進宮頸癌細胞凋亡、抑制細胞增殖，并通過抑制NF-κB信號通路來抑制宮頸癌細胞的遷移和入侵，因此推測miR-29a-DNMT1-SOCS1軸可能通過NF-κB信號通路來影響宮頸癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。Chen等[11]發(fā)現(xiàn)宮頸癌細胞中miR-29a表達下調(diào)，CDC42上調(diào)。熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示miR-29a通過直接靶向CDC42的3′UTR負調(diào)控其表達。過表達miR-29a后HeLa和CaSki細胞中的PAK1、p-PAK1、p-LIMK和p-cofilin的水平顯著下調(diào)，細胞凋亡明顯增加，而細胞增殖、遷移和侵襲受到明顯抑制，而過表達CDC42后可以部分恢復(fù)這些變化。Chen等[12]發(fā)現(xiàn)miR-29a-3p對SNIP1的mRNA和蛋白表達水平進行負調(diào)控，并且下調(diào)SNIP1下游基因(HSP27、c-Myc、Cyclin D1)的mRNA表達從而抑制了HeLa細胞的遷移和增殖，認為miR-29a-3p/SNIP1軸可以為宮頸癌的發(fā)展提供新的認識。在本研究中，我們通過熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn)miR-29a可以直接靶向CDK6的3′UTR，負調(diào)控CDK6的表達，并促進PC3細胞的增殖過程，同樣起到抑癌基因的作用，與其他研究中的結(jié)論相似，但作用靶點不同。

CDK6與Cyclin D密切相關(guān)，二者可形成復(fù)合物而促使Rb蛋白發(fā)生磷酸化并失活，促進細胞從G1期進入S期。CDK6在大多數(shù)腫瘤中呈高表達，具有抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤血管生成等作用，與腫瘤進展密切相關(guān)[13]。有研究報道，CDK6在宮頸癌組織中呈高表達，且其表達水平與宮頸癌的臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HPV感染呈顯著的正相關(guān)性[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，HPV16 E7陽性細胞中CDK6表達上調(diào)，從而促進細胞的增殖。而轉(zhuǎn)染miR-29a mimic可以顯著降低CDK6蛋白表達水平，提示miR-29a高表達對腫瘤細胞中致癌基因CDK6表達具有抑制作用，并抑制細胞的增殖。

綜上所述，HPV16 E7可以下調(diào)腫瘤細胞中miR-29a的表達水平，而miR-29a可通過直接抑制CDK6的表達，進一步促進細胞增殖和抑制其凋亡。這一結(jié)果提示E7-miR-29a-CDK6信號可能是高危型HPV致使細胞發(fā)生惡性增殖新的重要途徑，而恢復(fù)miR-29a的表達至少可以部分逆轉(zhuǎn)E7的促增殖效應(yīng)，這為腫瘤的分子治療提供了新的靶點。