何 登， 劉海意

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430030

腎臟缺如是一種臨床罕見的先天性出生缺陷，其中胎兒雙腎缺如畸形則更為罕見，遺傳是其主要致病因素，但發(fā)病機(jī)制尚不明確。雙腎缺如胎兒往往表現(xiàn)為孕中晚期羊水缺失或羊水過少，通過產(chǎn)前B超或MRI檢查而被發(fā)現(xiàn)。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，全外顯子測序(whole exome sequenceing，WES)等技術(shù)逐漸被廣泛運用于婦產(chǎn)及遺傳學(xué)科領(lǐng)域，為腎缺如的產(chǎn)前診斷方法提供了新的選擇，也為探索其遺傳病因及相關(guān)機(jī)制提供了科學(xué)手段。

基因Jagged1(JAG1)變異可致常染色體顯性遺傳疾病Alagille綜合征1型(Alagille syndrome 1)，主要表現(xiàn)為：腎發(fā)育不良、膀胱輸尿管返流、集合管系統(tǒng)重復(fù)、局灶節(jié)段性腎小球硬化、肋骨異常、肝功能衰竭、室間隔缺損、房間隔缺陷、法洛四聯(lián)征、主動脈縮窄、腎動脈狹窄、腎小管性酸中毒等。本研究中，我們對1例經(jīng)彩超檢查發(fā)現(xiàn)的雙腎缺如胎兒，通過全外顯子組測序檢測為其產(chǎn)前診斷提供了相應(yīng)依據(jù)，發(fā)現(xiàn)此前未曾報道的JAG1基因第16號外顯子雜合缺失可能參與了胎兒腎缺如畸形的組織學(xué)發(fā)生。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

該家系于2020年9月24日因“孕19+6周，彩超檢查發(fā)現(xiàn)胎兒雙腎缺如2 d”收入華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院產(chǎn)科?；颊咭蛟l(fā)不孕于我院生殖中心行ET術(shù)開始本次妊娠，2020年9月7日彩超檢查提示：雙頂徑4.0 cm，頭圍15.1 cm，腹圍13.2 cm，股骨長2.3 cm，胎兒相當(dāng)于孕16+4周；胎盤附著于子宮底部及后壁，羊水最大前后徑0.9 cm。初步診斷：羊水過少，胎兒心臟大血管內(nèi)徑異常。予以營養(yǎng)支持及改善胎盤循環(huán)治療，并于2020年9月23日復(fù)查胎兒彩超提示：胎兒雙側(cè)腎臟未見明顯回聲，無羊水，胎兒孕周相當(dāng)于18周；同時胎兒心臟彩超提示胎兒室間隔缺損可能(胎兒室間隔上部0.11 cm回聲連續(xù)性中斷)，靜脈導(dǎo)管PI值增高(1.30)。胎兒父母非近親結(jié)婚，無不良藥物或環(huán)境接觸史。既往史、家族史無特殊?；颊呷朐和暾\斷：胎兒畸形(Potter綜合征？室間隔缺損？)，羊水過少，妊娠合并糖尿病，ET術(shù)后，孕19+6周，G1P0。經(jīng)遺傳咨詢后，胎兒父母要求終止妊娠行病因?qū)W檢查，并簽署知情同意書。本研究經(jīng)過華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 檢測方法

1.2.1 標(biāo)本采集及DNA提取 經(jīng)過利凡諾羊膜腔注射引產(chǎn)后，取引產(chǎn)兒腹股溝股內(nèi)側(cè)直徑2.5 cm肌肉組織及引產(chǎn)胎兒父母外周血5 mL，應(yīng)用北京天根生化科技有限公司的DNA提取試劑盒提取全基因組DNA，并保存于4 ℃環(huán)境。

1.2.2 文庫構(gòu)建及全外顯子組測序 經(jīng)過片段化、末端修復(fù)、3′段加A尾，連接測序接頭、文庫片段篩選及PCR擴(kuò)增到DNA文庫。應(yīng)用Agilent Sureselect Human All Exon V6試劑盒進(jìn)行全外顯子雜交捕獲，對于雜交獲得的外顯子文庫進(jìn)行清洗和純化，獲得富集的外顯子DNA文庫。PCR擴(kuò)增后進(jìn)行磁珠純化，得到待上機(jī)的DNA文庫。用Agilent BiosystemsTM7500 Real time PCR systems儀器平臺進(jìn)行qPCR文庫定量，之后上機(jī)測序。illumina測序平臺PE150測序策略為樣本的測序條件。最后得到下機(jī)數(shù)據(jù)用于生物信息學(xué)分析。

1.2.3 全外顯子測序分析 對生成的Fastq格式的原始文件進(jìn)行評估，并過濾掉Q30堿基未達(dá)到80%以上的數(shù)據(jù)。將通過質(zhì)控的數(shù)據(jù)用Burrow-Wheeler Aligner(BWA，Version 0.7.12)比對人類參考基因組，用SAM tools(Version 1.3)將比對后的文件轉(zhuǎn)換為BAM格式，Genome Analysis Toolkit(GATK，Version 3.3)對其進(jìn)行變異檢測。Annovar對變異進(jìn)行注釋，再根據(jù)注釋信息對變異進(jìn)行如下過濾：①過濾掉變異堿基型深度低于5×(即A0<5)的變異，以減少由測序誤差導(dǎo)致的變異；②過濾掉東亞人群數(shù)據(jù)庫中AF> 0.05的變異(優(yōu)先級：ExAC東亞人群> 1000 Genomes東亞人群)；③篩選出非良性變異；④過濾掉內(nèi)含子、基因間區(qū)中的變異；⑤過濾掉同義變異；⑥過濾掉在本地外顯子數(shù)據(jù)庫中AF>0.05的變異；⑦過濾掉隱性遺傳病基因中單一的雜合變異。

1.2.4 生物信息學(xué)分析方法及數(shù)據(jù)庫 變異位點致病性評級及數(shù)據(jù)解讀規(guī)則參考美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(ACMG)指南及ClinGen序列變異解釋(Sequence Variant Interpretation，SVI)專家組對指南標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用建議[1-3]，排除千人基因組、人類外顯子數(shù)據(jù)庫、人群基因組突變頻率數(shù)據(jù)庫、神州基因組數(shù)據(jù)庫等數(shù)據(jù)庫中突變頻率大于1%的變異位點，去除非功能性變異位點(如同義突變、非編碼區(qū)突變等)，再經(jīng)過致病性預(yù)測(SIFT、Polyphen2、CADD等軟件)、臨床癥狀對照、相關(guān)疾病數(shù)據(jù)庫查詢與文獻(xiàn)參考等綜合考慮，找到候選基因變異位點進(jìn)行家系驗證。所用注釋數(shù)據(jù)庫為：Human Genome 38(hg38/GRCh38)、RefSeq、dbSNP、1000 Genomes phase3、ExAC、gnomAD、神州基因組數(shù)據(jù)庫等數(shù)據(jù)庫，所用解讀數(shù)據(jù)庫包括DGV、DECIPHER、OMIM、UCSC、ClinVar、HGMD及PubMed等數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果

2.1 引產(chǎn)胎兒產(chǎn)前彩超及引產(chǎn)后大體觀

引產(chǎn)兒產(chǎn)前彩超檢查提示胎兒雙腎缺如異常，引產(chǎn)后大體觀可見胎兒面容鼻梁稍寬符合Alagille綜合征的面部畸形表現(xiàn)，同時觀察雙上臂未見明顯異常，雙下肢未見明顯殘缺畸形等情況(圖1)。

2.2 全外顯子組測序分析結(jié)果

通過全外顯子組測序?qū)σa(chǎn)兒組織及父母血液樣本檢測，發(fā)現(xiàn)引產(chǎn)兒JAG1基因16號外顯子疑似雜合性缺失，父親和母親均未發(fā)生缺失(圖2)。全外顯子組測序-染色體數(shù)目變異(WES-CNV)結(jié)果顯示引產(chǎn)兒變異染色體位置位于chr20：10645355-10645502，區(qū)段為20p12.2。經(jīng)公共數(shù)據(jù)庫查詢，基因JAG1(OMIM：601920)的突變會導(dǎo)致常染色體顯性遺傳疾病Alagille綜合征1型。

A：受檢引產(chǎn)胎兒JAG1基因第16號外顯子雜合缺失；B：引產(chǎn)兒父親未見JAG1基因16號外顯子缺失；C：引產(chǎn)兒母親未見JAG1基因16號外顯子缺失圖2 全外顯子組測序檢測范圍內(nèi)染色體數(shù)目變異結(jié)果Fig.2 CNV results within WES detection

受檢者樣本未檢測到與本案例表型相關(guān)的致病性SNV、In Dels變異，不過檢測到1個重點關(guān)注位點：受檢引產(chǎn)標(biāo)本及父系均為EYA1基因c.361G>C雜合突變，而母系為野生型。根據(jù)ACMG指南及ClinGen序列變異解釋(Sequence Variant Interpretation，SVI)專家組對指南標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用建議[1-3]，基因EYA1的c.361G>C突變?yōu)橐粋€意義未明突變位點，與常染色體顯性遺傳疾病“鰓-耳-腎綜合征1型伴或不伴白內(nèi)障”相關(guān)。其位于EYA1基因6號外顯子c.361G>C：p.A121P。該變異發(fā)生于Eyes absent homologue 1功能結(jié)構(gòu)域，疾病特征與本案例表型相符度為部分相符，在人群基因組突變頻率數(shù)據(jù)庫(gnomAD)中的頻率為5.43951E-05。該變異在神州基因組數(shù)據(jù)庫、人類外顯子數(shù)據(jù)庫(ExAC)和參考人群千人基因組(1000G)中沒有發(fā)現(xiàn)。

本研究對原始標(biāo)本行全基因組檢測同時發(fā)現(xiàn)3號染色體q21.3處重復(fù)0.48 Mb區(qū)域，經(jīng)查詢DGV、DECIPHER、OMIM、ClinGen、UCSC、gnomAD以及PubMed公共數(shù)據(jù)庫資源，未找到與該片段相關(guān)的明確致病信息和文獻(xiàn)報道(圖3)。

A：全基因檢測結(jié)果；B：3號染色體檢測結(jié)果圖3 全基因組檢測同時發(fā)現(xiàn)3號染色體q21.3處重復(fù)0.48 Mb區(qū)域Fig.3 The repeat 0.48 Mb region of chromosome 3 q21.3 found by genome-wide detection

3 討論

Jagged1(JAG1)基因突變或缺失是目前已知的常染色體顯性遺傳病Alagille綜合征(20p11缺失綜合征)(MIM #118450)的常見致病原因[4]。JAGl有大于36 kb的26個外顯子，可編碼組成1218個氨基酸的Jaggedl蛋白，后者是Notch信號途徑中的重要配體。JAGl基因突變或缺失使其編碼的蛋白能力下降，從而引起Notch信號傳導(dǎo)途徑異常，進(jìn)而造成胚胎細(xì)胞、組織、器官的分化和發(fā)育異常[5]。文獻(xiàn)報道JAGl基因突變在全部26個外顯子上均有發(fā)現(xiàn)，沒有明顯引起Alagille綜合征的熱點位置[6]。本研究收集雙腎缺如引產(chǎn)胎兒組織及胎兒父母外周血，對受檢者樣本進(jìn)行全外顯子組測序CNV檢測(WES-CNV)，發(fā)現(xiàn)JAG1基因16號外顯子疑似雜合缺失。

經(jīng)公共數(shù)據(jù)庫查詢，基因JAG1(OMIM：601920)的突變會導(dǎo)致常染色體顯性遺傳疾病Alagille綜合征1型(OMIM：118450)。Alagille綜合征1型主要表現(xiàn)為：腎發(fā)育不良、膀胱輸尿管返流、集合管系統(tǒng)重復(fù)、局灶節(jié)段性腎小球硬化、肋骨異常、肝功能衰竭、室間隔缺損、房間隔缺陷、法洛四聯(lián)征、主動脈縮窄、腎動脈狹窄、腎小管性酸中毒、半椎體、尺骨發(fā)育低下、不完全外顯、嬰兒期發(fā)病、表現(xiàn)度差異。關(guān)于JAG1突變引起Alagille綜合征腎缺如病例比較少見，較早文獻(xiàn)報道1例Alagille綜合征患者經(jīng)產(chǎn)前檢測發(fā)現(xiàn)存在多囊性腎發(fā)育不良的表現(xiàn)[7]。結(jié)合引產(chǎn)胎兒彩超提示雙腎缺如結(jié)果、胎兒父母泌尿系彩超結(jié)果及WES-CNV結(jié)果顯示父親和母親均未發(fā)生缺失，考慮本病例可能為胎兒父母雙方JAG1雜合突變引起胎兒JAG1基因雜合缺失可能。

此外，在本研究中受檢者樣本未檢測到與本病例表型相關(guān)的致病性SNV、In Del變異。已有研究發(fā)現(xiàn)了80多種位于8q13.3染色體的EYA1基因的突變可引起鰓-耳-腎綜合征[8-10]。鰓-耳-腎綜合征(OMIM #113650、#610896)是一種常染色體顯性遺傳病，其表現(xiàn)包括鰓裂缺陷(存在側(cè)頸部瘺管或囊腫)、耳凹、聽力損失以及腎臟異常，包括腎臟未發(fā)育和發(fā)育不全。鰓-耳-腎綜合征的發(fā)病率為1/40000。鰓-耳-腎綜合征患者的外顯度可能不全，可能僅具備一個或兩個特征[11]。并非所有患者都會出現(xiàn)腎異常，同一家族中不同成員的腎臟異?？赡懿煌?。腎臟表現(xiàn)包括腎缺如或發(fā)育不全(單側(cè)或雙側(cè))、VUR、UPJO或輸尿管重復(fù)畸形[12]。EYA1基因負(fù)責(zé)編碼腎發(fā)育期間在后腎間充質(zhì)中表達(dá)的一種轉(zhuǎn)錄輔因子[13]。EYA1基因與SIX基因家族成員相互作用，后者負(fù)責(zé)編碼控制后腎間充質(zhì)中PAX2和GDNF蛋白產(chǎn)物表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。鰓-耳-腎綜合征家族中還存在SIX1基因(位于14q23.1染色體)和SIX5基因的突變。本研究發(fā)現(xiàn)基因EYA1的c.361G>C突變與常染色體顯性遺傳疾病鰓-耳-腎綜合征1型(Branchiootorenal syndrome 1)相關(guān)?？紤]為意義未明突變位點可能，即EYA1∶NM_000503.6∶exon6∶c.361G>C∶p.A121P變異。該變異發(fā)生于Eyes absent homologue 1功能結(jié)構(gòu)域，而且變異在神州基因組數(shù)據(jù)庫、人類外顯子數(shù)據(jù)庫(ExAC)和參考人群千人基因組(1000G)中沒有發(fā)現(xiàn)，在人群基因組突變頻率數(shù)據(jù)庫(gnomAD)中的頻率為5.43951E-05。EYA1(OMIM∶601653)的突變會導(dǎo)致臨床上鰓-耳-腎綜合征1型發(fā)生，表現(xiàn)為：腎發(fā)育不良、羊水過少、膀胱輸尿管返流、腎缺如、多囊性腎發(fā)育不良、外耳道狹窄、小耳畸形、耳蝸發(fā)育不全、鰓裂瘺管、鰓裂囊腫、表現(xiàn)度差異、不完全外顯。結(jié)合患病胎兒羊水過少及雙腎缺如病理改變，EYA1基因變異可能與本病例發(fā)病相關(guān)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)了中孕期雙腎缺如胎兒病變可能與JAG1基因16號外顯子雜合缺失密切相關(guān)，此外，基因EYA1的c.361G>C突變?yōu)橐粋€意義未明突變位點，亦可能與胎兒雙腎缺如相關(guān)。本研究也存在一定局限性，由于雙腎缺如胎兒病例極為罕見，后續(xù)將進(jìn)一步搜集病例和驗證我們的新發(fā)現(xiàn)結(jié)果。目前全外顯子組檢測已成熟應(yīng)用于遺傳咨詢，然而也存在一定局限：①全外顯子組檢測主要針對全外顯子組區(qū)域及剪切邊界5 bp范圍內(nèi)的單堿基變異(SNVs)和外顯子區(qū)域50 bp以內(nèi)的插入/缺失(In Dels)，不包含poly結(jié)構(gòu)、串聯(lián)重復(fù)序列、富含GC區(qū)域以及存在同源相似序列(假基因)，同時對50 bp以上的插入/缺失(In Dels)存在一定的局限性；②全外顯子組捕獲的技術(shù)局限性，目前全外顯子組檢測不能保證覆蓋100%的外顯子區(qū)域；③多基因病及其他非遺傳因素(感染、藥物、輻射等環(huán)境因素)引起的可能性。本研究首次報道JAG1基因第16號外顯子雜合缺失可能與胎兒雙腎缺如為臨床特征的Alagille綜合征1型疾病相關(guān)，本發(fā)現(xiàn)對遺傳咨詢領(lǐng)域相關(guān)資料提供了一定程度的補(bǔ)充。