余 豪， 汪珉杰， 王 旋， 姜曉兵

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科，武漢 430022

膠質(zhì)瘤是成人最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，世界衛(wèi)生組織(WHO)根據(jù)腫瘤形態(tài)學(xué)特征將膠質(zhì)瘤分為4個不同的病理級別[1]。間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤(WHO Ⅲ級)，惡性程度僅次于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(WHO Ⅳ級)，約占總膠質(zhì)瘤的20%，手術(shù)切除聯(lián)合放化療是目前主要的治療方案。間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者的中位生存時間約為37.6個月，其中IDH突變型伴1p/19q共缺失的患者預(yù)后相對較好，IDH野生型伴1p/19q未缺失的患者預(yù)后相對較差[2]。然而，即使是分型相同的間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者，其預(yù)后差異仍較大，說明現(xiàn)有的標(biāo)記物對患者預(yù)后的預(yù)測能力有限。因此，亟需探尋間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤中新的預(yù)后相關(guān)基因，從而更精準(zhǔn)地區(qū)分不同預(yù)后的患者，并以此為靶點實現(xiàn)進一步的個體化治療。

腫瘤免疫微環(huán)境(TME)是指腫瘤細(xì)胞與腫瘤內(nèi)部的免疫細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等)相互作用形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)[3]。近年來，腫瘤免疫微環(huán)境在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中起到的重要作用被不斷揭示[4]。例如，CD8+T細(xì)胞和M1樣巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗癌作用；而M2樣巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)分泌大量免疫抑制因子，抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞的正常功能，從而促進腫瘤進展[5]。同時，研究者不斷探索能夠調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)鍵基因。比如發(fā)現(xiàn)SYT16與膠質(zhì)瘤預(yù)后及免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)[6]；LGALS1調(diào)控膠質(zhì)瘤免疫抑制性微環(huán)境的形成等[7]。然而，目前多數(shù)研究是以膠質(zhì)瘤或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤為整體進行免疫調(diào)控基因的研究，但對間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤中免疫相關(guān)預(yù)后基因的研究相對缺乏。本研究通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，量化間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣本的免疫浸潤情況。對低免疫浸潤組、中免疫浸潤組和高免疫浸潤組患者間的生存曲線進行計算，并對兩兩組間的差異基因進行分析，最終找到免疫浸潤相關(guān)的核心風(fēng)險基因ZAP70。利用臨床患者手術(shù)標(biāo)本及患者預(yù)后隨訪信息驗證ZAP70表達量與間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者預(yù)后的關(guān)系，并通過GSEA富集分析了解ZAP70的相關(guān)通路，以期深入了解間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤免疫相關(guān)基因ZAP70的功能，從而更好地指導(dǎo)臨床工作[8]。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源與膠質(zhì)瘤樣本收集

通過TCGA數(shù)據(jù)庫下載間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤(WHO Ⅲ級)患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及臨床信息，剔除生存數(shù)據(jù)缺失的樣本，用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。新鮮腫瘤樣本來源于華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科，選取2010年1月至2017年12月入院進行手術(shù)的膠質(zhì)瘤患者，術(shù)中留取患者腫瘤組織樣本，將其置于4%多聚甲醛中保存，參照病理檢測報告進行腫瘤分級，并進行石蠟包埋，分別制作數(shù)張空白切片備用，剩余以組織塊形式保存，術(shù)后對患者進行生存信息隨訪(統(tǒng)一在2020年6月進行電話隨訪)。從腫瘤組織樣品中選取WHO Ⅲ級的膠質(zhì)瘤患者樣本進行后續(xù)免疫組化分析。

1.2 生物信息學(xué)分析

ssGSEA(single sample GSEA)是主要針對單樣本無法使用GSEA而提出的一種實現(xiàn)方法。根據(jù)表達譜文件計算每個基因的rank值，可以得到每個樣本的免疫細(xì)胞或者免疫功能、免疫通路的活性，然后根據(jù)免疫活性進行分組。首先基于ssGSEA算法量化免疫浸潤程度，再通過聚類分析將間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣本分為低、中、高免疫浸潤組。通過K-M曲線對上述3組患者進行兩兩組間比較，并找出差異顯著(P<0.05)且表達差異在2倍以上的基因。然后通過蛋白互作關(guān)系在線分析網(wǎng)站(https：//www.string-db.org/)找出核心基因，并采用單因素Cox回歸分析計算出核心基因中有預(yù)后價值的基因[9]。挑選上述結(jié)果中最核心的風(fēng)險基因ZAP70，對ZAP70表達量與間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤臨床信息的相關(guān)性進行探索，并利用GSEA分析ZAP70在間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤中相關(guān)的信號通路[10]。

1.3 免疫組化與表達量分析

新鮮腫瘤組織石蠟切片進行免疫組化及表達量分析。通過對切片的脫蠟，梯度乙醇脫水，洗滌，抗原修復(fù)，封閉(SAP-100，索萊寶，北京)，ZAP70抗體(A2195，ABclonal，中國)及二抗孵育，洗滌后進行光學(xué)顯微鏡下DAB顯色(ZLI-9017，索萊寶，北京)。掃描免疫組化染色切片，通過Image J軟件對免疫組化結(jié)果進行量化，將入組患者分為ZAP70高、低表達兩組。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

ssGSEA、差異基因分析、單因素Cox回歸分析、K-M曲線生存分析等統(tǒng)計學(xué)分析均采用R 4.0.2軟件進行。數(shù)據(jù)均通過Shapiro-Wilk test進行正態(tài)性檢測，Wilcoxon-Mann-Whitney檢驗用于差異基因分析，t檢驗用于臨床特征亞組之間的表達量比較。熱圖、火山圖、韋恩圖、散點圖、森林圖等均用R語言繪制，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤納入樣本信息及免疫浸潤分組

通過對TCGA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)下載整理，以及對生存時間缺失數(shù)據(jù)的剔除，共納入間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣本236例。其中男性135例，女性101例。組織學(xué)分型：間變性星形細(xì)胞瘤111例，間變性少突星行細(xì)胞瘤51例，間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤74例。IDH突變型169例，野生型67例。1p/19q共缺失70例，未缺失166例。MGMT啟動子甲基化190例，未甲基化46例。TERT啟動子突變型71例，野生型71例，未知94例。ATRX突變型74例，野生型162例。轉(zhuǎn)錄組分型：經(jīng)典型(classical，CL)32例、原神經(jīng)細(xì)胞型(proneural，PN)94例、神經(jīng)元型(neural，NE)35例、間質(zhì)型(mesenchymal，ME)19例，未知56例。如圖1熱圖顯示，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)采用ssGSEA方法量化腫瘤免疫浸潤細(xì)胞，其中紅色越深代表含量越高，藍色越深代表含量越低。同時以無監(jiān)督層次聚類算法將間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣本根據(jù)免疫細(xì)胞浸潤情況分為低免疫浸潤組(n=57)、中免疫浸潤組(n=167)和高免疫浸潤組(n=12)。

圖1 236例間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣本免疫浸潤分組Fig.1 Clustering of 236 anaplastic glioma samples based on immune infiltration level

2.2 間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤低、中、高免疫浸潤組預(yù)后及差異基因分析

利用K-M曲線比較低、中、高免疫浸潤組間的總生存時間差異。如圖2A所示，低免疫浸潤組的預(yù)后最佳，中免疫浸潤組次之，高免疫浸潤組的預(yù)后最差，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00011)。隨即分析不同免疫浸潤組間差異表達的基因，結(jié)果顯示：與低免疫浸潤組相比，中免疫浸潤組中1421個基因上調(diào)，231個基因下調(diào)(圖2B)；而與中免疫浸潤組相比，高免疫浸潤組中1905個基因上調(diào)，2149個基因下調(diào)(圖2C)。通過對上述兩組差異基因進行交集處理與韋恩圖的繪制(圖2D)，得到在間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣本中與免疫浸潤顯著相關(guān)的762個基因，其中包括709個上調(diào)基因與53個下調(diào)基因。

A：低、中、高免疫浸潤組K-M生存曲線；B：低、中免疫浸潤組差異基因火山圖；C：中、高免疫浸潤組差異基因火山圖；D：低、中、高免疫浸潤組差異基因韋恩圖圖2 間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤3個免疫浸潤組預(yù)后及差異基因分析Fig.2 Prognosis and differential gene analysis of three immune infiltration groups with anaplastic glioma

2.3 核心風(fēng)險基因篩選

將上述762個差異基因進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出互作打分大于0.95的節(jié)點。通過統(tǒng)計各個基因鄰近節(jié)點數(shù)判定核心基因。圖3A顯示前30個核心差異基因，其中包括基質(zhì)分子(FN1、COL1A1、COL3A1、COL5A1、COL5A2)，趨化因子及受體(CCL5、CCL20、CXCL9、CXCL10、CCR2、CCR5)，細(xì)胞因子(IL-10、IL-6)及白細(xì)胞相關(guān)抗原(HLA-DRA、HLA-DMA、HLA-DRB1、HLA-DQA1、HLA-DMB、HLA-DPA1、HLA-DQB1)等。單因素Cox回歸分析進一步對以上核心基因的預(yù)后風(fēng)險進行評估，可得其中16個基因為影響間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤預(yù)后的風(fēng)險基因，并且其中ZAP70的風(fēng)險比值最高(圖3B)。

A：核心基因柱狀圖；B：核心基因單因素Cox回歸分析結(jié)果森林圖圖3 核心風(fēng)險基因篩選Fig.3 Screening of core risk genes

2.4 ZAP70表達量與間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者預(yù)后及臨床特征相關(guān)性分析

圖4中K-M生存曲線結(jié)果顯示，ZAP70高表達的間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者生存時間顯著少于ZAP70低表達患者(P<0.05)。對ZAP70表達量與多個臨床特性間的關(guān)系進行研究，結(jié)果如圖5所示：在236例間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣本中，ZAP70的表達量在不同性別以及不同組織學(xué)分型中無顯著差異(P>0.05)。大于60歲的老年患者中ZAP70的表達量顯著高于不足60歲的患者(P<0.05)；IDH野生型患者中ZAP70的表達量顯著高于IDH突變型患者(P<0.05)；1p/19q未缺失患者中ZAP70的表達量顯著高于1p/19q共缺失患者(P<0.05)；MGMT啟動子未甲基化患者中ZAP70的表達量顯著高于MGMT啟動子甲基化患者(P<0.05)；ATRX野生型患者中ZAP70的表達量顯著高于ATRX突變型患者(P<0.05)；TERT啟動子突變患者中ZAP70的表達量顯著高于TERT啟動子野生型患者(P<0.05)；根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分型，經(jīng)典型與間質(zhì)型患者中ZAP70的表達量顯著高于神經(jīng)元型與前神經(jīng)元型患者(P<0.05)。

圖4 間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者ZAP70表達量K-M生存曲線分析Fig.4 K-M curve analysis of ZAP70 expression in patients with anaplastic glioma

圖中數(shù)值為P值圖5 ZAP70表達量與間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤臨床特性的關(guān)系Fig.5 Relationship between ZAP70 expression and clinical features of anaplastic glioma

2.5 臨床樣本驗證ZAP70表達量與間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤預(yù)后關(guān)系

收集本院間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤的樣本并對患者進行隨訪，共納入61例間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣本，根據(jù)免疫組化染色結(jié)果將ZAP70的表達量由低到高分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(圖6A)。Ⅰ、Ⅱ級定義為低表達組(31例)，Ⅲ、Ⅳ級定義為高表達組(30例)。通過K-M生存曲線比較高、低表達組的預(yù)后差異，結(jié)果顯示：低表達組具有相對更好的預(yù)后趨勢，但是差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.115)，可能是樣本數(shù)過低導(dǎo)致，需要在后期納入更多數(shù)量的樣本(圖6B)。

圖6 間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣本ZAP70免疫組化染色(A)及K-M生存曲線分析(B)Fig.6 IHC(A) and K-M survival curve(B) analysis of ZAP70 with anaplastic glioma samples

2.6 GSEA分析間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤中ZAP70富集的相關(guān)通路

如圖7所示，間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤中ZAP70的表達量與10條有生物學(xué)意義的通路顯著相關(guān)。GSEA富集分析結(jié)果顯示高表達ZAP70與耐藥(ABC_TRANSPORTERS)、細(xì)胞粘附信號(FOCAL_ADHESION)、細(xì)胞外基質(zhì)反應(yīng)(ECM_RECEPTOR_INTERACTION)相關(guān)。同時，高表達ZAP70能夠激活JAK-STAT以及NOTCH信號通路。在腫瘤免疫方面，高表達ZAP70與白細(xì)胞遷移(LEUKOCYTE_TRANSENDOTHELIAL_MIGRATION)及固有免疫缺失(PRIMARY_IMMUNODEFICIENCY)相關(guān)。

圖7 間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤ZAP70多GSEA富集分析Fig.7 Multi-GSEA analysis of ZAP70 in anaplastic glioma

3 討論

間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤是臨床上較為常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，雖然多數(shù)情況下惡性程度不如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，但是間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者的預(yù)后差異較大，現(xiàn)有的分子標(biāo)記物對間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者預(yù)后的預(yù)測能力有限。因此亟需新的標(biāo)記物用以將間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者作進一步分類，進而采取更加個體化的治療方案[11]。腫瘤免疫是近年來腫瘤診斷治療方面研究的熱點，免疫微環(huán)境對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到關(guān)鍵作用，反之腫瘤細(xì)胞的基因改變也不斷重塑著腫瘤免疫微環(huán)境[12]。通常情況下，膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以釋放多種細(xì)胞因子促進各種免疫細(xì)胞的浸潤，如MDSCs、小膠質(zhì)細(xì)胞、Treg、巨噬細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞進入腫瘤微環(huán)境，并將上述細(xì)胞轉(zhuǎn)化為可以幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視的表型[13]。

因此，本研究從免疫細(xì)胞浸潤的角度出發(fā)，通過免疫浸潤算法將公共數(shù)據(jù)庫中間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣本按照免疫浸潤等級進行分類。在分類結(jié)果的低、中、高免疫組中，免疫細(xì)胞浸潤的程度越高，患者的預(yù)后越差。為了探索間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤中促進腫瘤免疫微環(huán)境形成的關(guān)鍵因素，我們通過進一步的差異基因分析、核心基因分析以及Cox回歸風(fēng)險基因篩選，發(fā)現(xiàn)ZAP70是促進免疫細(xì)胞浸潤且預(yù)后相關(guān)風(fēng)險比最高的基因。在對ZAP70表達量與患者臨床信息的相關(guān)性研究中，ZAP70在多種惡性臨床特性的患者中高表達，比如老年患者、IDH野生型患者、1p/19q未缺失患者、MGMT未甲基化患者以及TERT啟動子突變患者[14-16]。GSEA分析揭示了ZAP70的相關(guān)惡性通路，臨床間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣本的免疫組化及預(yù)后分析也再一次驗證了生物信息學(xué)分析的結(jié)果。

ZAP70編碼蛋白屬于蛋白酪氨酸激酶家族，在T細(xì)胞發(fā)育和淋巴細(xì)胞活化中發(fā)揮作用。該酶在T細(xì)胞抗原受體刺激后在酪氨酸殘基上磷酸化，與Src家族激酶、Lck和Fyn一起在TCR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的初始階段發(fā)揮作用。同時ZAP70也在腫瘤細(xì)胞中表達，前列腺癌與淋巴細(xì)胞性白血病中ZAP70能夠促進腫瘤細(xì)胞侵襲與遷移[17-18]。目前對ZAP70的研究在血液腫瘤中較多，在實體瘤尤其是膠質(zhì)瘤中尚未有研究。本文初步對ZAP70在間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達情況進行探討并對其臨床意義進行分析，提示了ZAP70在間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者預(yù)后預(yù)測中的重要價值，其有望成為間變性膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者中預(yù)后不佳亞群的有效治療靶點。