郭聰慧，李清華，丁林舒，黃建豪，黃曉剛，衛(wèi)恒習(xí)，張守全

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510642)

全氟辛酸 (Perfuorooctanoic aid, PFOA)是一種耐光解、水解和生物降解的人工合成的全氟類化合物，因含有諸多碳氟鍵而具有極其穩(wěn)定的性質(zhì)，常被用作防油脂或防水劑以及衣服、家具和其他產(chǎn)品的保護(hù)性涂層，此外還可用作地板拋光劑、黏合劑、消防泡沫和電線絕緣等[1-3]。隨著PFOA的廣泛應(yīng)用，在大氣、河流、土壤等環(huán)境介質(zhì)中均檢測(cè)出PFOA殘留：上海市41個(gè)室內(nèi)灰塵樣本中PFOA平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為279.4 ng/g，長(zhǎng)江流域重慶段地表水中PFOA的檢出率為100%，質(zhì)量濃度在1.16～49.87 ng/L之間，全國(guó)31個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)土壤中PFOA 的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.35 ng/g[4-6]，人類和動(dòng)物可通過飲食飲水等方式暴露于PFOA，且由于PFOA半衰期長(zhǎng)，有生物累積效應(yīng)，故能在體內(nèi)聚積，進(jìn)而引發(fā)毒性，但不同物種、不同暴露年齡，引發(fā)毒性的濃度不同且差異較大[7]。研究發(fā)現(xiàn)，PFOA具有免疫毒性、發(fā)育毒性和內(nèi)分泌干擾毒性[8]。在雌性生殖系統(tǒng)中，PFOA暴露會(huì)抑制卵巢激素分泌，損害卵泡發(fā)育，導(dǎo)致卵巢功能喪失[9]。并且PFOA還可通過氧化應(yīng)激和凋亡顯著抑制孕鼠黃體功能[10]。此外，新生大鼠注射PFOA可以減少生長(zhǎng)卵泡和次級(jí)卵泡的數(shù)量[11]。雖然已有研究報(bào)道了PFOA暴露對(duì)生殖系統(tǒng)的影響，但關(guān)于PFOA對(duì)卵母細(xì)胞影響的研究依然很少。已知PFOA可以通過血卵屏障進(jìn)入卵泡液[12]，本試驗(yàn)通過給小鼠灌服PFOA模擬體內(nèi)暴露來(lái)探討其對(duì)小鼠卵母細(xì)胞成熟率及成熟質(zhì)量的影響。通過檢測(cè)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平、紡錘體形態(tài)、細(xì)胞骨架來(lái)評(píng)估卵母細(xì)胞暴露于PFOA后的細(xì)胞變化。本研究將有助于揭示PFOA影響卵母細(xì)胞發(fā)育過程的毒理學(xué)機(jī)制，并引起人們對(duì)PFOA安全性的關(guān)注。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 6周齡體質(zhì)量相近的昆明雌性小鼠，購(gòu)買于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 試劑 PFOA(171468, Sigma)，ROS 檢測(cè)試劑盒 (S0033, Beyotime)，β-tubulin (T5293, Sigma)，內(nèi)磷酸化組蛋白H2A.X(Phospho-histone H2A.X，P-H2A.X，sc-51748, Santa Cruz)，F(xiàn)ITC 偶聯(lián)山羊抗鼠 IgG (A11029, LIFE)，Hoechst 33342 (H3570,LIFE)，孕馬血清促性腺激素(PMSG，寧波第二激素廠)，人絨毛膜促性腺激素(hCG，寧波第二激素廠)，透明質(zhì)酸酶(H3506，Sigma)

1.1.3 試劑配制 PFOA：超純水溶解，配制不同濃度的PFOA以使得最終基于小鼠體質(zhì)量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0、5、10 和 20 mg/kg。

1.1.4 儀器 CO2培養(yǎng)箱，體視顯微鏡，熒光倒置顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組 將160只6周齡的昆明小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每個(gè)劑量組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8只小鼠。分籠后，先適應(yīng)環(huán)境7 d，再進(jìn)行藥物灌服試驗(yàn)。飼養(yǎng)環(huán)境為 12 h 光照、12 h 黑暗交替，飲食飲水自由。

1.2.2 藥物灌服處理 適應(yīng)環(huán)境 1 周后，以每天0、5、10、20 mg/kg 的劑量分別給對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠灌服PFOA，每次灌服0.2 mL，連續(xù)灌服 14 d。劑量及時(shí)間的選定參照PFOA相關(guān)的體內(nèi)試驗(yàn)[13]。

1.2.3 卵母細(xì)胞的收集 小鼠連續(xù)灌服 PFOA 2 周后進(jìn)行超排處理，每只小鼠注射10 IU PMSG，間隔48 h 后注射 10 IU hCG，再間隔 13.5 h 后頸部脫臼處死，用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液浸泡30 s消毒，隨后解剖取出輸卵管，找到膨大部，在含有PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中用尖頭鑷撕開膨大部，用口吸管移出卵母細(xì)胞，放入預(yù)熱好的1 g/L的透明質(zhì)酸酶溶液中，處理2 min，待顆粒細(xì)胞脫掉以后將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至PBS緩沖液中洗3遍。收集同一劑量處理組的小鼠卵母細(xì)胞至少100個(gè)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞成熟率 卵母細(xì)胞排出第一極體視為成熟，取出卵母細(xì)胞后統(tǒng)計(jì)第一極體的排出率。

1.2.5 卵母細(xì)胞活性氧含量的檢測(cè) 每個(gè)劑量組隨機(jī)取 25～30 個(gè)卵母細(xì)胞放入含有 1 μmol/L DCFHDA的成熟培養(yǎng)液液滴中洗滌2～3遍，再放入37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱孵育20 min。而后用DPBS-PVA緩沖液洗3次，每次1 min。在熒光顯微鏡下用同一曝光參數(shù)觀察并拍照，應(yīng)用ImageJ軟件分析平均熒光強(qiáng)度[14]。

1.2.6 卵母細(xì)胞免疫熒光染色分析 四孔板每個(gè)孔加入 200 μL 固定液，然后置于 37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱預(yù)熱30 min，每個(gè)劑量組隨機(jī)取25～30個(gè)卵母細(xì)胞置入四孔板中，于培養(yǎng)箱中固定30 min。然后將卵母細(xì)胞放入加有洗脫緩沖液的四孔板中于培養(yǎng)箱內(nèi)封閉2 h。再用β-tubulin(按照1∶1 000 的體積比稀釋)或 P-H2A.X(按照 1∶200 的體積比稀釋) 4 ℃條件下孵育過夜。次日用洗脫緩沖液洗滌3次，每次10 min。然后與FITC偶聯(lián)山羊抗鼠IgG(按照1∶100的體積比稀釋)在37 ℃條件下孵育1 h。之后，避光環(huán)境下用洗脫緩沖液洗滌 3 次，每次 10 min。用 Hoechst 33342 室溫下進(jìn)行DNA染色5 min。最后，將卵母細(xì)胞固定在載玻片上，并在熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)5次，用SPSS 23.0進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行多重比較分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，作圖軟件為GraphPad 8。

2 結(jié)果與分析

2.1 灌服PFOA抑制小鼠卵母細(xì)胞體外成熟

與對(duì)照組相比，每日灌服不同劑量(5、10和20 mg/kg)PFOA小鼠的卵母細(xì)胞成熟率有明顯下降(表1)。10和20 mg/kg劑量組小鼠的卵母細(xì)胞成熟率分別下降了14.28%和28.17%；5 mg/kg劑量組和對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)，10 mg/kg組和對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)，20 mg/kg組和對(duì)照組差異極顯著 (P＜0.01)。5、10和 20 mg/kg 組別之間兩兩相比差異顯著(P＜0.05)。

表1 PFOA對(duì)小鼠卵母細(xì)胞成熟率的影響Table 1 Effect of PFOA on maturation of mouse oocytes

2.2 灌服PFOA誘發(fā)卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激

與對(duì)照組相比，每日灌服不同劑量PFOA小鼠的卵母細(xì)胞內(nèi)ROS含量有明顯升高(圖1)。10和20 mg/kg組中卵母細(xì)胞內(nèi)ROS含量分別升高了135%和177%；5 mg/kg組和對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)，10 和 20 mg/kg組與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)，10 與 20 mg/kg組之間差異不顯著(P＞0.05)(圖2)。

圖1 不同劑量 PFOA暴露的卵母細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)熒光圖像Fig. 1 Fluorescence images of reactive oxygen species(ROS) in oocytes exposed to different doses of PFOA

圖2 不同劑量 PFOA暴露的卵母細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)熒光強(qiáng)度Fig. 2 The fluorescence intensities of reactive oxygen species (ROS) in oocytes exposed to different doses of PFOA

2.3 灌服PFOA誘發(fā)卵母細(xì)胞DNA損傷

每日灌服不同劑量PFOA的小鼠卵母細(xì)胞P-H2A.X免疫熒光結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)DNA損傷情況有明顯升高 (圖3)。其中，5、10 和 20 mg/kg 組P-H2A.X 比例分別比對(duì)照組升高了47%、133%和171%。5 mg/kg 組與對(duì)照組差異顯著 (P＜0.05)，10、20 mg/kg組與對(duì)照組相比差異極顯著(P＜0.01)，10 和 20 mg/kg組之間差異不顯著 (P＞0.05)(圖4)。

圖3 不同劑量PFOA暴露的卵母細(xì)胞內(nèi)P-H2A.X熒光圖像Fig. 3 Fluorescence images of P-H2A.X in oocytes exposed to different doses of PFOA

圖4 不同劑量PFOA暴露的卵母細(xì)胞DNA損傷比例Fig. 4 DNA damage rates of oocytes exposed to different doses of PFOA

2.4 灌服PFOA誘發(fā)卵母細(xì)胞骨架受損

每日灌服不同劑量PFOA的小鼠卵母細(xì)胞β-tubulin、Hoechst 33342 免疫熒光結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)紡錘體形態(tài)和染色體排列有明顯異常(圖5)，且與PFOA劑量呈正相關(guān)。與對(duì)照組相比，10和20 mg/kg組中卵母細(xì)胞β-tubulin形態(tài)異常，染色體非整齊排列的比例分別升高了65.06%和75.60%。5 mg/kg 組與對(duì)照組差異不顯著 (P＞0.05)，10、20 mg/kg組與對(duì)照組相比均差異顯著(P＜0.05)，10和 20 mg/kg組之間差異不顯著 (P＞0.05)(圖6)。

圖5 不同劑量PFOA暴露的卵母細(xì)胞骨架熒光圖像Fig. 5 Fluorescence images of cytoskeleton of oocytes exposed to different doses of PFOA

圖6 不同劑量PFOA暴露的卵母細(xì)胞骨架異常比例Fig. 6 The proportions of abnormal cytoskeleton in oocytes exposed to different doses of PFOA

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，人們對(duì)環(huán)境污染物的關(guān)注度越來(lái)越高。PFOA作為一種穩(wěn)定的有機(jī)化合物給工業(yè)和制造業(yè)帶來(lái)便利的同時(shí)也帶來(lái)了諸多“副作用”。PFOA在環(huán)境中持久存在，使得人類或動(dòng)物很容易受到污染。飲食、飲水是人類暴露PFOA的主要途徑。本試驗(yàn)通過給小鼠灌服PFOA模擬人類的暴露途徑，觀察PFOA對(duì)雌性哺乳動(dòng)物的生殖毒性。結(jié)果證實(shí)了PFOA可通過氧化應(yīng)激、DNA損傷和細(xì)胞骨架受損降低卵母細(xì)胞成熟率以及成熟質(zhì)量。

ROS是細(xì)胞代謝的天然副產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)有著重要作用。當(dāng)ROS的產(chǎn)生和中和不平衡時(shí)就會(huì)引起氧化應(yīng)激。過量的ROS會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、蛋白降解、DNA損傷等[15]。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境污染物和毒素往往會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，最終誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激并發(fā)揮毒性[16]。已有研究表明PFOA可引起小鼠卵巢內(nèi)ROS升高，且呈劑量依賴性[15]。為了研究PFOA對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響，我們檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)ROS水平，發(fā)現(xiàn)PFOA可顯著增加細(xì)胞內(nèi)ROS含量，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，進(jìn)而抑制卵母細(xì)胞發(fā)育，且劑量越高，氧化應(yīng)激越強(qiáng)。

據(jù)報(bào)道，ROS相關(guān)氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)DNA損傷[17]。P-H2A.X被用作鑒定DNA損傷，在細(xì)胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂的數(shù)分鐘內(nèi)，H2AX的139位絲氨酸殘基被ATM、ATR、PRKC基因磷酸化形成P-H2A.X。因此，P-H2A.X的出現(xiàn)與DNA雙鏈斷裂緊密關(guān)聯(lián)，故其可作為DNA雙鏈斷裂的標(biāo)志物[18]。已有研究報(bào)道毒性化學(xué)制劑可誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷，如雙酚AF(Bisphenol AF)通過增加氧化應(yīng)激和DNA損傷對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟產(chǎn)生負(fù)面影響，對(duì)羥基苯甲酸丁酯(Butylparaben)通過DNA損傷抑制豬卵母細(xì)胞的體外成熟[19-20]。于是我們猜測(cè)，PFOA暴露會(huì)誘導(dǎo)卵母細(xì)胞DNA雙鏈斷裂。試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了我們的猜想，PFOA處理組的P-H2A.X陽(yáng)性卵母細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，提示PFOA暴露可通過誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂來(lái)抑制卵母細(xì)胞的成熟。

在減數(shù)分裂進(jìn)程中，染色體的正確分離主要取決于染色體-微管的穩(wěn)定連接。紡錘體微管的形態(tài)異常引起染色體的錯(cuò)誤分離，導(dǎo)致卵母細(xì)胞和進(jìn)一步胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生異倍體和基因組的不穩(wěn)定現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的環(huán)境毒素與紡錘體形態(tài)異常、染色體分裂錯(cuò)誤有關(guān)。研究報(bào)道雙酚A替代物雙酚芴可引起卵母細(xì)胞骨架受損[21]；鄰苯二甲酸單酯能夠干擾減數(shù)分裂過程中染色體分離和配子形成[22]。本研究中，PFOA處理后的卵母細(xì)胞有很大比例出現(xiàn)紡錘體異常和染色體錯(cuò)位。微管、肌動(dòng)蛋白絲和染色質(zhì)相互作用完成染色體分離，建立細(xì)胞不對(duì)稱[23-24]。β-tublin在PFOA處理的卵母細(xì)胞中的異常定位是紡錘體缺陷的原因之一。紡錘體缺陷導(dǎo)致異常的染色體排列。因此，本文結(jié)果表明，PFOA暴露可通過誘導(dǎo)紡錘體缺陷和染色體排列異常進(jìn)而抑制卵母細(xì)胞的成熟。這些發(fā)現(xiàn)有助于提高人們對(duì)PFOA生殖毒性的認(rèn)識(shí)，為今后的研究提供參考依據(jù)。未來(lái)可以對(duì)PFOA損傷哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的分子機(jī)制做進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究評(píng)估了PFOA體內(nèi)暴露對(duì)小鼠卵母細(xì)胞的影響，結(jié)果表明PFOA暴露會(huì)通過誘導(dǎo)ROS生成、DNA損傷、紡錘體形態(tài)發(fā)育缺陷、染色體排列異常等途徑影響卵母細(xì)胞成熟率及成熟質(zhì)量。