覃柳琪，董先明，蘇祥郁，周武藝，鄭文旭

(1 生物基材料與能源教育部重點實驗室，廣東 廣州510642； 2 華南農(nóng)業(yè)大學 材料與能源學院，廣東 廣州510642)

聚乳酸 (Polylactic acid, PLA)是一種生物可降解聚合物材料，是以含糖、淀粉、纖維素等生物質(zhì)材料為原料，經(jīng)發(fā)酵制成乳酸，再由乳酸聚合而成的高分子材料。PLA在熔融狀態(tài)下具有良好的流變性和優(yōu)異的可加工性，這奠定了PLA在熔融沉積型3D打印材料中的主導地位。但PLA脆性大、親水性差以及降解物呈酸性等不足，依然限制著其在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應用。將聚合物如聚己內(nèi)酯(Polycaprolactone, PCL)[1-2]、聚丙烯 (Polypropylene,PP)[3]、無機粒子如羥基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)[4]等引入PLA的熔融共混過程，有利于改善上述情況。在組織工程支架的構(gòu)建中，100～1 000 μm的大孔有助于細胞向支架內(nèi)生長，有利于血管形成及骨骼向內(nèi)生長；而1～10 μm的微孔則有利于細胞黏附與發(fā)育[5]。可見，制備含有微孔結(jié)構(gòu)的支架對組織修復是極其有益的。通過在鈦管中積累羥基磷灰石球體制備多孔生物陶瓷支架，雖然能構(gòu)建出直徑小于10 μm的豐富微孔，但該方法很難滿足支架的個性化制造[6-7]。將高度個性化的3D打印技術(shù)與發(fā)泡技術(shù)相結(jié)合制備含微孔支架存在操作過程繁雜、穩(wěn)定性差、機械性能差異大及重復性低等不足[8-9]。而冷凍干燥與溶出結(jié)合的制備方法雖操作簡單，但易導致孔洞分散不均，缺乏孔隙內(nèi)連接，同時受成型方式及造孔機理的制約，此方法成型單一，難以制造厚支架，不利于組織工程的實際應用[10-11]。為此，針對以上不足，在相關(guān)研究基礎(chǔ)上[12-13]，本研究將PCL用于增韌PLA/HA復合材料，通過在PLA/HA/PCL復合材料中添加發(fā)泡劑偶氮二甲酰胺(Azodicarbonamide, ADC)或制孔劑氯化鈉(Sodium chloride, NaCl)，采用熔融共混并擠出拉絲制備生物基3D打印用標準線材[ 直徑為(1.75±0.05) mm]，系統(tǒng)探究生物基PLA復合材料通過熔融沉積型3D打印構(gòu)建含微孔支架的可行性。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

聚乳酸(PLA)，4032D，美國NatureWorks公司；聚己內(nèi)酯(PCL)，capa6500，瑞典Perstorp公司；w為99%的納米級羥基磷灰石(HA)，西安通澤生物科技有限公司；氯化鈉(NaCl)，過200目篩，國藥集團化學試劑有限公司；偶氮二甲酰胺(ADC)，西亞化學科技(山東)有限公司；小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞 (Bone marrow mesenchymal stemcells, BMSCs)，CRL12424，美國 ATCC；胎牛血清 (Fetal bovine serum, FBS)、DMEM 培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液，美國Gibco公司；鈣黃綠AM(Calcein-AM)、碘化丙啶(PropidiumIodide, PI)，日本同仁化學研究所。

雙螺桿擠出機，SHJ-20B，南京杰恩特機電有限公司；3D打印耗材生產(chǎn)線，MESI-25，廣州市普同實驗分析儀器有限公司；桌面式3D打印機，F(xiàn)S-200，廣州飛勝智能科技股份有限公司；萬能電子測試儀，UTM4204，深圳新三思縱橫科技股份有限公司；熱重分析儀，TG209F1LibraTM，德國耐馳儀器制造有限公司；差示掃描量熱儀，DSC8000，英國Polymer Laboratories公司；掃描式電子顯微鏡，EVO MA 15，美國珀金埃爾默公司；共聚焦顯微鏡，TCS SP-8，德國徠卡公司。

1.2 含NaCl或ADC的PLA復合材料線材制備

參照前期試驗及研究結(jié)果[14-15]，以PLA和HA質(zhì)量比為9∶1，增韌相PCL的質(zhì)量分數(shù)固定為15%，熔融共混后得PLA/HA/PCL復合材料，作為空白樣，標記為PHAP。再分別將制孔劑NaCl、發(fā)泡劑ADC與PLA/HA/PCL進行熔融共混，其中NaCl按照10%、20%、30%和40%的質(zhì)量分數(shù)添加，分別標記為10%NaCl-PHAP、20%NaCl-PHAP、30%NaCl-PHAP和40%NaCl-PHAP；ADC按照0.2%、0.4%、0.6%和0.8%的質(zhì)量分數(shù)添加，分別標記為 0.2%ADC-PHAP、0.4%ADC-PHAP、0.6%ADC-PHAP和0.8%ADC-PHAP。上述復合材料樣品均先通過雙螺桿擠出機進行熔融擠出、造粒，最后再經(jīng)過3D打印耗材生產(chǎn)線制備出直徑為(1.75 ± 0.05) mm 的 3D 打印線材，螺桿轉(zhuǎn)速為 25 r/min，螺桿各溫區(qū)溫度分別為185、190、190和185 ℃。

1.3 PLA復合材料3D打印支架制備

將所制備的線材用于桌面式3D打印機，實現(xiàn)各支架的個性化打印。其中，支架模型設(shè)計為帶正六邊形(蜂窩狀)孔徑的圓柱形支架，支架的直徑為20 mm、高度 10 mm，正六邊形 (蜂窩)的邊長為 1.5 mm。

1.4 PLA復合材料線材熱性能表征

熱重測試 (Thermogravimetric analysis, TG)在氮氣氛圍下，程序以20 ℃/min的升溫速率從35 ℃升溫到600 ℃進行，先將樣品進行為期3 d的浸泡溶出試驗，每8 h換1次水，烘干后分別取2～5 mg復合材料線材進行測試。θ0為起始分解溫度，θmax為最大降解速率溫度，θend為終止分解溫度。試驗同時記錄微商熱重分析(Derivative thermogravimetry,DTG)結(jié)果。

采用差示掃描量熱儀(Differential scanning calorimet, DSC)開展熱性能測試時，取 5～10 mg 樣品裝于鋁坩堝中，再用標準壓片機對坩堝進行密封。程序第1次加熱掃描從50 ℃到200 ℃，為了消除熱歷史，程序在200 ℃下保溫5 min，冷卻后再進行第2次升溫掃描，記錄材料的玻璃化溫度(θg)、熔融溫度 (θm)、最大轉(zhuǎn)變峰、熔融焓 (ΔΗm)、結(jié)晶度(Xc)。其中，結(jié)晶度由如下公式計算：

1.5 PLA復合材料3D打印支架表面形貌測試

利用掃描電子顯微鏡在電場加速電壓為5.00 kV，電流為25 pA的環(huán)境下，觀察蜂窩狀支架表面形貌。試驗截取固定高度的蜂窩支架，側(cè)貼在導電膠上，通過導電膠包圍支架進一步固定后觀察支架形貌，并截取圖片。

1.6 PLA復合材料3D打印支架孔隙率測試

根據(jù)液體置換法測量支架的孔隙率(P)，用無水乙醇作為進入支架孔的運動流體。計算如下所示：

式中，V1為初始乙醇的體積，V2為多孔支架與乙醇充分接觸后的體積，V3為取出支架后剩余乙醇的體積。每組樣品進行5個平行樣的測定，取平均值進行繪圖統(tǒng)計。

1.7 PLA復合材料3D打印支架力學性能測試

壓縮試驗從應力-應變圖獲得支架的機械性能，包括應力、應變對應關(guān)系等，測試樣品是直徑與厚度為2∶1的圓形腳手架，20 kN稱重傳感器以2 mm/min的壓縮速度施加載荷。重復5次平行試驗獲取平均值。

1.8 PLA復合材料3D打印支架細胞毒性測試

將BMSCs培養(yǎng)在添加10%(φ)FBS溶液的DMEM培養(yǎng)基中。將材料置于12孔板中，加入75% (φ)乙醇溶液浸泡 2 h 后, 用無菌 PBS 清洗3次，然后加入細胞培養(yǎng)液浸泡12 h后，將20 μL細胞懸液(每孔3×104)接種到材料上，2 h后加入500 μL 完全培養(yǎng)基，置于 37 ℃、5% (φ)CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取樣，PBS漂洗，再加入Calcein-AM和PI，避光孵育25 min后，PBS漂洗1次，最后利用共聚焦顯微鏡觀察材料表面細胞活性并采集圖片。采用Image J軟件統(tǒng)計不同樣品圖片中的細胞存活和死亡的數(shù)量。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。假定方差齊性，組間兩兩比較采用LSD法檢驗；未假定方差齊性，組間兩兩比較采用Tamhane’s T2檢驗，P＜0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 含NaCl或ADC的PLA復合材料線材及其3D打印支架形態(tài)特征

將水溶性NaCl、發(fā)泡劑ADC分別與PLA復合材料熔融共混加工，得到如圖1所示的系列3D打印線材，由圖1可知，0.6%ADC-PHAP、0.8%ADCPHAP的線材略顯淡黃色，其他線材均呈白色，此外，0.8%ADC-PHAP出現(xiàn)明顯的膨脹、彎曲現(xiàn)象，不適用于3D打印，其他復合材料粗細均勻、表面光滑，具備3D打印條件。

圖1 用于制備3D打印支架的線材Fig. 1 Wires used for scaffolds preparation by 3D printing

圖2分別是由40%NaCl-PHAP和0.6%ADCPHAP線材打印的蜂窩狀支架實物，這2種復合材料的3D打印成型效果優(yōu)異，其中，40%NaCl-PHAP支架的孔徑均勻，支架呈白色；而0.6%ADC-PHAP支架略微膨脹，顯淡黃色。為了更有效地探究含微孔支架的構(gòu)建情況，在后續(xù)研究中，重點討論制孔劑、發(fā)泡劑添加量較高的40%NaCl-PHAP和0.6%ADC-HAPP樣品，同時，試驗以10%NaCl-PHAP和0.2%ADC-PHAP作為對比樣，PHAP為空白參照樣。

圖2 3D打印蜂窩結(jié)構(gòu)支架實物圖Fig. 2 Physical images of 3D printed scaffolds with honeycomb structure

2.2 PLA復合材料的熱性能

圖3為聚乳酸復合材料的TG和DTG曲線圖，由TG圖(圖3a)可知，在試驗加工溫度下，復合材料均具有良好的熱穩(wěn)定性。但NaCl或ADC的加入，均使復合材料的初始熱分解溫度降低，且存在ADC的復合材料初始熱分解溫度進一步降低的情況。表1列出了復合材料的熱降解具體數(shù)值，相較PHAP空白樣，含ADC質(zhì)量分數(shù)為0.6%的復合材料的初始分解溫度降低了約35 ℃，這可能是由于發(fā)泡材料孔內(nèi)存在的氧氣促進了PLA基質(zhì)的熱分解，而0.6%ADC-PHAP產(chǎn)生的孔洞更豐富，比表面積更大，與氧氣的接觸面增大，反應活性更高，因此其初始熱分解溫度比0.2%ADC-PHAP復合材料更低[17]，這一結(jié)果與Abu Hassan等[18]的發(fā)現(xiàn)一致。殘余量數(shù)值顯示，浸出3 d后，NaCl被部分去除，10%NaCl-PHAP、40%NaCl-PHAP復合材料的殘余量分別達到17.26%(理論殘余率17.65%，其中，NaCl 10%、HA 7.65%)和 37.96%(理論殘余率 45.10%，其中，NaCl 40%、HA 5.10%)，對比不同 NaCl添加量的復合材料殘余率可知，當添加的NaCl質(zhì)量分數(shù)達到40%時，整體材料的質(zhì)量損失率最大。這是因為NaCl的添加量越多，聚合物內(nèi)可形成連續(xù)的晶粒狀，易于被水溶出，而當NaCl的添加量較少時，晶粒周圍被高聚物緊密包裹，無法被水洗出，所以當NaCl的添加量越低時，其熱重殘余率越逼近理論殘余率。

圖3 PLA復合材料的TG曲線和DTG曲線Fig. 3 TG and DTG curves of PLA composites

表1 PLA復合材料熱降解數(shù)值統(tǒng)計Table 1 Numerical statistics of thermal degradation of PLA composites

PLA復合材料的DSC升溫曲線如圖4所示，與之對應的DSC測試數(shù)值結(jié)果如表2所示。在相同的加工條件下，含制孔劑NaCl的復合材料的θg和θm變化不大，添加發(fā)泡劑ADC的質(zhì)量分數(shù)達到0.2%時，0.2%ADC-PHAP復合材料的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度比空白樣PHAP提高了4 ℃。NaCl、ADC的加入，均使復合材料的熔融焓下降。從圖4觀察到0.6%ADC-PHAP出現(xiàn)2個熔融峰，這意味著聚合物中存在不同形式的晶體?？梢?，發(fā)泡劑對0.2%ADC-PHAP、0.6%ADC-PHAP復合材料中晶體結(jié)構(gòu)的形成有影響。具有較低熔融溫度的晶體可能與在冷結(jié)晶期間形成的較小晶粒有關(guān)，而具有較高熔融溫度的晶體是在一次結(jié)晶過程中所形成的微晶[19]。

圖4 PLA復合材料的DSC升溫曲線Fig. 4 DSC heating curve of PLA composites

2.3 3D打印支架的微觀形貌分析

表2 PLA復合材料的DSC測試結(jié)果Table 2 DSC test results of PLA composites

圖5分別為 PHAP、40%NaCl-PHAP和0.6%ADC-PHAP復合材料構(gòu)造的3D打印蜂窩結(jié)構(gòu)支架掃描電鏡圖。由圖5可知，PHAP復合材料打印的蜂窩狀支架表面光滑，表面均勻分散的白點為復合材料中分散的羥基磷灰石。分別由40%NaCl-PHAP和0.6%ADC-PHAP復合材料構(gòu)建的蜂窩狀支架表面更粗糙，其中，40%NaCl-PHA支架表面存在立方狀孔洞，這是由于聚合物中正八面體的NaCl晶體溶出后留下的，但類似孔洞并不豐富。由此可知，40%NaCl-PHAP支架中仍殘留大量被高聚物包裹的NaCl，這些NaCl留在支架內(nèi)部無法被水溶出。0.6%ADC-PHAP復合材料構(gòu)建的蜂窩狀支架表面存在大小均勻的球狀孔洞結(jié)構(gòu)，該支架的大部分孔徑直徑范圍為10～50 μm，張學盈等[20]在探究偶氮二甲酰胺對聚氯乙烯發(fā)泡材料性能的影響中也有類似的觀察。從SEM圖(圖5)還可以觀察到直徑小于5 μm的孔洞，因此，由Zhou等[5]的統(tǒng)計可知，這些孔洞對細胞黏附和發(fā)育更有利?？梢?，ADC質(zhì)量分數(shù)為0.6%的0.6%ADC-PHAP復合材料可通過3D打印技術(shù)，制備出富含微孔的支架。

圖5 PLA復合材料3D打印支架SEM圖Fig. 5 SEM image of PLA composites 3D printed scaffold

2.4 3D打印支架的孔隙率分析

圖6 為 3D 打印 PHAP、10%NaCl-PHAP、40%NaCl-PHAP、0.2%ADC-PHAP和 0.6%ADCHAPP支架的孔隙率統(tǒng)計結(jié)果。由圖6可知，40%NaCl-PHAP和0.6%ADC-HAPP 2種支架具有更高的孔隙率，分別達到62.78%和63.33%，結(jié)合圖5的SEM圖可知，40%NaCl-PHAP和0.6%ADCHAPP 2種支架上存在的微孔一定程度上提高了支架對乙醇的吸附性能，使得二者的孔隙率測試結(jié)果均高于 PHAP、10%NaCl-PHAP和0.2%ADCPHAP這3種支架。對各支架的孔隙率進行差異顯著性分析，發(fā)現(xiàn)40%NaCl-PHAP的孔隙率顯著高于 PHAP、10%NaCl-PHAP 支架 (P＜0.05)，0.6%ADC-HAP支架的孔隙率極顯著高于PHAP和0.2%ADC-PHAP支架的(P＜0.01)。

圖6 PLA復合材料3D打印支架孔隙率Fig. 6 Porosity of PLA composites 3D printed scaffold

2.5 3D打印支架的壓縮性能分析

圖7是3D打印蜂窩結(jié)構(gòu)支架的力學試驗結(jié)果。由壓縮應力、應變曲線可以看出，40%NaCl-PHAP和0.6%ADC-PHAP 2種支架在應變達到35%之后，曲線出現(xiàn)較為明顯的波動，這是內(nèi)部結(jié)構(gòu)出現(xiàn)坍塌的結(jié)果，當應變達到65%之后，應力開始急劇上升，這是由支架結(jié)構(gòu)致密化導致的結(jié)果。在壓縮應變?yōu)?0%時，PHAP、10%NaCl-PHAP和40%NaCl-PHAP 3種支架的壓縮應力分別為67.15、60.75和52.11 MPa，當添加的ADC的質(zhì)量分數(shù)為0.2%時，支架相應的壓縮應力與PHAP支架相差不大，達到了67.34 MPa，但隨著ADC質(zhì)量分數(shù)的進一步提高，0.6%ADC-PHAP支架的壓縮應力僅為45.27 MPa。結(jié)合圖5支架的SEM可知，相比空白樣品PHAP支架，40%NaCl-PHAP和0.6%ADCPHAP 2種支架的力學性能減弱是支架微孔化引起的不良結(jié)果。

圖7 PLA復合材料3D打印支架壓縮性能Fig. 7 Compression performance of 3D printed scaffold using PLA composites

2.6 3D打印支架對細胞黏附的影響

圖8為PHAP、40%NaCl-PHAP和0.6%ADCPHAP 3種3D打印支架在共聚焦顯微鏡下觀察到的BMSCs細胞染色圖。在進行細胞染色試驗之前，將含NaCl的樣品進行了為期3 d的浸泡溶出試驗。由圖8可知，在同樣的操作條件下，40%NaCl-PHAP和0.6%ADC-PHAP 2種支架表面觀察到的細胞數(shù)量明顯比PHAP支架多，這是因為含微孔的支架表面的粗糙度提高了。同時，由SEM圖(圖5)觀察到小于10 μm的微孔，也對細胞的黏附起到積極作用。在40%NaCl-PHAP支架上觀察到較多的紅色細胞，PHAP和0.6%ADC-PHAP 2種支架表面基本沒有觀察到紅色，可見含NaCl的支架不利于細胞的成長。對比發(fā)現(xiàn)，0.6%ADC-PHAP支架表現(xiàn)出較高的細胞活性，是更具應用潛力的含微孔支架。計數(shù)結(jié)果 (圖 9)顯示，PHAP、40%NaCl-PHAP和0.6%ADC-PHAP支架的細胞存活率分別為 (98.60±0.43)%、(88.49±1.02)% 和 (99.06±0.16)%,40%NaCl-PHAP支架的細胞存活率極顯著低于PHAP、0.6%ADC-PHAP 支架的 (P＜0.01)。

圖8 3D打印支架接種BMSC細胞染色的共聚焦顯微鏡照片F(xiàn)ig. 8 Confocal microscope photo of 3D printed scaffold inoculated with BMSC cells

圖9 3D打印支架接種BMSC細胞的存活率Fig. 9 Cell survival statistics of live/dead staining of 3D printed scaffold inoculated with BMSC cells

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，含NaCl或ADC的PLA復合材料線材適用于熔融沉積型3D打印，可用于制備含微孔支架。NaCl或ADC的加入，均使得PLA復合材料的初始分解溫度降低，0.6%ADC-PHAP復合材料的初始分解溫度比40%NaCl-PHAP復合材料低19.5 ℃，比空白樣 PHAP低 35 ℃。所構(gòu)建的0.6%ADC-PHAP支架力學性能雖有所減弱，但其孔隙率比空白樣高，達到63.33%，差異具有統(tǒng)計學意義。同時，該支架除了含有直徑為10～50 μm的微孔之外，還存在有利于細胞黏附的、直徑小于5 μm的孔洞。所構(gòu)建的0.6%ADC-PHAP支架比40%NaCl-PHAP支架表現(xiàn)出更好的細胞存活率，在組織工程中具有較好的應用潛力。